研究背景：
　　CRISPR-Cas系统来源于微生物的免疫系统，是基因编辑领域最近出现的最有效的工具。此系统中sgRNA负责靶向目的DNA片段，Cas蛋白则对靶向序列进行切割。CRISPR-Cas系统切割靶序列时，需要识别与靶序列毗邻的PAM。不同种类的Cas蛋白识别不同的PAM序列。
　　研究目的:
　　为了实现利用CRISPR-Cas系统对目的基因的精准切割，促进其在医疗，农业等领域的应用，研究者们已经从开发了多种识别不同PAM的Cas蛋白。在确定新发现Cas蛋白的功能性PAM方面，已经存在一些方法，但是这些PAM定义方法大多不是在人类细胞中进行，或者采用反向筛选，有的还使用了无催化活性的Cas9。这些方法不能直接地反映CRISPR-Cas在人类细胞中的功能性PAM。为了促进CRISPR-Cas系统在人类细胞中的应用，我们开发了一种利用可视化的片段敲除定义CRISPR-Cas功能性PAM的方法，PAM-DOSE(PAMDefinitionbyObservableSequenceExcision)。
　　研究方法：
　　本文构建了含有若干随机碱基的双荧光报告系统库，然后将CRISRPR-Cas系统与其一同转染HEK-293D细胞。当文库中的tdTomato被CRISPR-Cas系统敲除后，我们使用PCR的方式提取含有功能性PAM的DNA片段进行测序。
　　研究结果：
　　本实验利用普遍认可的SpCas9测试PAM-DOSE方法在定义Cas蛋白功能性PAM的可行性。随后我们使用PAM-DOSE定义了FnCas12a和SpCas9-NG的功能性PAM。其结果基本符合前人的研究。同时我们还发现靶序列的差异也一定程度上影响了Cas蛋白PAM的偏好性。
　　研究结论：
　　通过使用SpCas9对不同位点pmTmGPAM库进行切割并定义了不同种类Cas蛋白功能性PAM后，我们证明PAM-DOSE在CRISPR-Cas系统PAM确定上是可行的，这是一种利用可视化的片段敲除方式定义CRISPR-Cas功能性PAM的新方法。