【摘 要】
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利用CRISPR/Cas9基因敲入技术建立稳定表达FUS(fused in sarcoma)的细胞系.方法:扩增FUS 5arm序列,puro-T2A-GFP报告基因,FUS 3arm序列,将3个片段一次连接至目的载体上.制作
【机 构】
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南京医科大学,江苏 南京,210000
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利用CRISPR/Cas9基因敲入技术建立稳定表达FUS(fused in sarcoma)的细胞系.方法:扩增FUS 5arm序列,puro-T2A-GFP报告基因,FUS 3arm序列,将3个片段一次连接至目的载体上.制作长链ssDNA做为同源重组模板.将FUS agRNA,cas9,ssDNA共转染hela和hct116细胞,通过细胞同源重组修复途径,实现报告基因GFP的敲入,嘌呤霉素筛选阳性细胞,流式分选纯化和富集带有绿色荧光的细胞,建立表达FUS-GFP融合蛋白的细胞系.结果:成功构建了带有FUS 5arm+puro-T2A-GFP+FUS 3arm的靶向载体质粒.琼脂糖凝胶显示ssDNA的成功产生.共聚焦显微镜显示转染后药筛48小时的hela和hct116细胞均出现绿色荧光.流式分选显示,带有绿色荧光的细胞比例约为30％-40％.结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了FUS-GFP荧光报告细胞系.
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