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研究背景
CRISPR/Cas9系统是目前应用的第三代基因编辑系统，由Cas9核酸酶与向导RNA(SmallguideRNA,sgRNA)组成，因其操作相对简单，成本相对低廉而被广泛应用。CRISPR/Cas9系统因其来源多种不同的细菌而具有多个种类，包括SpCas9(Streptococcuspyogenes)，SaCas9(Staphylococcusaureus)，NmCas9(Neisseriameningitides)，StCas9(Streptococcusthermophilus)和CjCas9(Campylobacterjejuni)等。目前最常用的是SpCas9，在微生物、动物和植物等领域中都有诸多的应用，如病原体检测、疾病模型构建、临床前基因治疗研究、植物育种等，是一个具有极大潜在应用的基因编辑工具。
SpCas9虽然具有较高的编辑效率，但却存在脱靶问题。脱靶，即能识别具有错配碱基的靶序列并进行编辑。当其对不该被编辑的地方进行了编辑，可能引发该基因的损伤，这是不容忽视和需要解决的问题。对此，研究人员开发了各种策略，比如对sgRNA进行改造、利用其它小分子或者光控系统来控制Cas9的表达、使用核糖核蛋白(RNP)转染以及对Cas9蛋白序列进行改造等。其中，对Cas9序列进行优化获得SpCas9高保真突变体(SpCas9-HF1,eSpCas9(1.1),evoCas9,HypaCas9,xCas9,NG-Cas9)是降低脱靶最直接的方式，维持活性的同时提高了保真性。
然而，有研究报道目前的高保真SpCas9(HFCas9)对靶序列的长度和错配十分敏感，普遍使用的U6启动子在转录时会额外增加一个G(G-sgRNA)，既造成了sgRNA长度的改变，也可能造成靶序列的错配，HFCas9的活性也会因此而大幅度的降低。由此，研究人员利用植物tRNA与sgRNA联合的策略，提高了突变体在植物中的编辑活性。
本研究探讨了植物的tRNA(Gly)能否在人类细胞中起作用，以及对tRNA进行优化，并比较野生型Cas9(WTCas9)与不同突变体(SpCas9-HF1,eSpCas9(1.1),xCas9(3.7))的差异，试图利用tRNA在人类细胞中提高HFCas9的活性。
研究目的
1.利用tRNA在人类293细胞中提高HFCas9的活性
2.比较不同HFCas9之间的活性与保真性
3.人tRNA对HFCas9的保真性是否有影响
研究方法
1.EGFP荧光报告系统：使用实验室先前构建的整合了EGFP荧光报告基因的293细胞系(293-SPC1)，针对EGFP基因设计sgRNA对EGFP进行编辑并判断效率。
2.流式细胞术：使用流式细胞仪判断非绿色荧光细胞的比例，以此判断Cas9的编辑效率。
3.T7E1分析：利用T7EndonucleaseI(T7E1)判断Cas9对内源性基因的编辑效率。
研究结果
1.植物tRNA与人tRNA在293细胞中对HFCas9的作用效果不同；
2.人不同的tRNA在293细胞中对HFCas9的作用效果也不同；
3.人tRNA在不同HFCas9上的表现不同；
4.人tRNA(Gln)对HFCas9的保真性几乎没有影响；
5.人tRNA(Gln)除了将额外不匹配的碱基去掉之外，推测可能存在其他机制影响HFCas9的编辑效率；
6.人tRNA(Gln)能提高HFCas9在遗传性视网膜劈裂症的疾病细胞模型中的修复效率。
CRISPR/Cas9系统是目前应用的第三代基因编辑系统，由Cas9核酸酶与向导RNA(SmallguideRNA,sgRNA)组成，因其操作相对简单，成本相对低廉而被广泛应用。CRISPR/Cas9系统因其来源多种不同的细菌而具有多个种类，包括SpCas9(Streptococcuspyogenes)，SaCas9(Staphylococcusaureus)，NmCas9(Neisseriameningitides)，StCas9(Streptococcusthermophilus)和CjCas9(Campylobacterjejuni)等。目前最常用的是SpCas9，在微生物、动物和植物等领域中都有诸多的应用，如病原体检测、疾病模型构建、临床前基因治疗研究、植物育种等，是一个具有极大潜在应用的基因编辑工具。
SpCas9虽然具有较高的编辑效率，但却存在脱靶问题。脱靶，即能识别具有错配碱基的靶序列并进行编辑。当其对不该被编辑的地方进行了编辑，可能引发该基因的损伤，这是不容忽视和需要解决的问题。对此，研究人员开发了各种策略，比如对sgRNA进行改造、利用其它小分子或者光控系统来控制Cas9的表达、使用核糖核蛋白(RNP)转染以及对Cas9蛋白序列进行改造等。其中，对Cas9序列进行优化获得SpCas9高保真突变体(SpCas9-HF1,eSpCas9(1.1),evoCas9,HypaCas9,xCas9,NG-Cas9)是降低脱靶最直接的方式，维持活性的同时提高了保真性。
然而，有研究报道目前的高保真SpCas9(HFCas9)对靶序列的长度和错配十分敏感，普遍使用的U6启动子在转录时会额外增加一个G(G-sgRNA)，既造成了sgRNA长度的改变，也可能造成靶序列的错配，HFCas9的活性也会因此而大幅度的降低。由此，研究人员利用植物tRNA与sgRNA联合的策略，提高了突变体在植物中的编辑活性。
本研究探讨了植物的tRNA(Gly)能否在人类细胞中起作用，以及对tRNA进行优化，并比较野生型Cas9(WTCas9)与不同突变体(SpCas9-HF1,eSpCas9(1.1),xCas9(3.7))的差异，试图利用tRNA在人类细胞中提高HFCas9的活性。
研究目的
1.利用tRNA在人类293细胞中提高HFCas9的活性
2.比较不同HFCas9之间的活性与保真性
3.人tRNA对HFCas9的保真性是否有影响
研究方法
1.EGFP荧光报告系统：使用实验室先前构建的整合了EGFP荧光报告基因的293细胞系(293-SPC1)，针对EGFP基因设计sgRNA对EGFP进行编辑并判断效率。
2.流式细胞术：使用流式细胞仪判断非绿色荧光细胞的比例，以此判断Cas9的编辑效率。
3.T7E1分析：利用T7EndonucleaseI(T7E1)判断Cas9对内源性基因的编辑效率。
研究结果
1.植物tRNA与人tRNA在293细胞中对HFCas9的作用效果不同；
2.人不同的tRNA在293细胞中对HFCas9的作用效果也不同；
3.人tRNA在不同HFCas9上的表现不同；
4.人tRNA(Gln)对HFCas9的保真性几乎没有影响；
5.人tRNA(Gln)除了将额外不匹配的碱基去掉之外，推测可能存在其他机制影响HFCas9的编辑效率；
6.人tRNA(Gln)能提高HFCas9在遗传性视网膜劈裂症的疾病细胞模型中的修复效率。