胆盐水解酶（Bile salt hydrolase,EC 3.5.1.24,BSH）是一类能够水解胆汁中结合胆盐生成游离胆酸和甘氨酸/牛磺酸的N-末端亲核（N-terminal nucleophilic,Ntn）水解酶,广泛存在于肠道微生物中,是诸多肠道微生物抵御胆盐胁迫的方式之一。然而,BSH与其生理功能的构效关系并不清楚,导致其在生物制剂中的应用开发缺少理论指导。本论文以唾液乳酸杆菌（Lactobacillus salivarius）LMG14476来源BSH为研究对象,以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NZ9000为指示菌,深入分析了BSH的结构、性质与细胞胆盐耐受能力三者的相关性,并初步探讨了BSH作用的分子机制。主要研究结果如下:1.BSH的表达对乳酸乳球菌胆盐耐受能力的影响在L.lactis NZ9000中分别表达了L.salivarius LMG14476来源的两种BSH（BSH1和BSH2）。通过比较重组菌在猪胆盐胁迫下的生长性能,发现胆盐胁迫20 h后,BSH1和BSH2表达菌株的生长性能比原始菌株分别提高了2.8和2.4倍,表明BSH的表达可显著提高重组菌的胆盐耐受能力;其中,胆盐胁迫15 h后,BSH1表达菌株的生长性能是BSH2表达菌株的1.3倍,表明BSH1的生物学性能好于BSH2。通过对细胞形态及胞内胆酸的定性定量分析,发现BSH2表达菌株胞内胆酸含量是BSH1表达菌株的1.5倍,表明低胆酸生成能力的BSH1有利于提高细胞胆盐耐受能力。2.BSH催化特性的定量表征酶学性质分析显示,BSH1和BSH2最适反应p H范围为5.5-7.0,反应温度在20-50℃可保持50%以上的水解活性;对6种底物的酶反应动力学曲线呈S型,hill系数大于1,表明两者均为正协同性变构酶;BSH1对6种结合胆盐的kcat和二级速率常数kcat/S0.5均小于BSH2,表明BSH1的催化效率及底物亲和力低于BSH2。以结合胆盐GCDCA为底物时,添加二硫苏糖醇（DTT）使BSH1和BSH2酶反应动力学S型曲线消失,kcat减小,kcat/S0.5增加,表明DTT会弱化BSH的变构特征,降低BSH的催化效率,增强底物亲和力。3.BSH的构效关系分析通过等温滴定微量热技术探测到BSH水解反应过程的热图呈现从放热向吸热转变的两阶段热力学特征,证实BSH的变构特性;并且,结合胆盐每次滴定酶液的量热曲线显示,水解过程首先出现吸热响应峰,表明BSH首先通过疏水相互作用与胆盐分子中的胆酸基团结合。分子对接模拟BSH1与胆酸基团的作用情况,发现胆酸基团通过疏水相互作用与位于BSH1表面的底物结合口袋结合。紫外吸收光谱分析发现胆酸基团引起BSH1的特征吸收峰由192 nm向201 nm红移,表明胆酸基团与BSH1底物结合口袋的结合引起BSH1的侧链伸展、蛋白骨架松散,利于埋在蛋白疏水腔中的活性位点Cys2的暴露。通过比对已有晶体结构信息的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）13来源BSH的氨基酸序列,预测BSH1与胆酸基团的结合位点为Tyr24、Ala58、Phe65、Phe130、Leu134。分别将Tyr24、Phe65、Phe130、Leu134替换为Ala,Ala58替换为Gln。突变体Y24A对结合胆盐GCA和GDCA没有活性,突变体A58Q和F65A对GCA没有活性,突变体F130A和L134A的底物特异性也分别变为TCA>GDCA>GCDCA=TDCA>GCA>TCDCA和TCDCA>TCA>GDCA=GCDCA>GCA>TDCA,该结果表明弱化位于BSH表面的底物结合口袋中氨基酸疏水性,可以影响或降低BSH的底物结合能力,提高BSH的底物专一性。4.BSH的分子改造强化细胞胆盐耐受性结合定点饱和突变与基因改组,构建BSH的突变体库,以重组菌在胆盐胁迫下的生物量为依据,从10,000个转化株中筛选到10株胆盐胁迫下生物量比野生型BSH1表达菌株提高了6-15%的重组菌。其中,在胆盐胁迫15 h后,生物量最高者NZ-bsh1v的生长性能相比于野生酶蛋白BSH1的表达菌株NZ-bsh1提高了1.3倍,经电镜观察和液质检测分析,发现NZ-bsh1v胞内胆酸生成量是NZ-bsh1的1/5,明显减少;该结果表明低胆酸生成能力的BSH具有较好的生物学性能。在E.coli BL21（DE3）中过量表达NZ-bsh1v中对应的BSH突变体并纯化。酶学特性及电泳分析显示,该突变体亚基分子量为6 k Da,是目前报道的亚基分子量最小的酶蛋白,且仅对结合胆盐中的三羟结合胆盐GCA和TCA有水解活性,比酶活分别为37.51±1.40U·mg^-1和69.74±1.69 U·mg^-1,该结果表明BSH突变体的底物专一性提高,活性降低。通过荧光光谱分析,发现相比于野生型BSH1的329 nm,BSH突变体内源荧光的最大发射波长为339 nm,发生了红移,且荧光强度也降低,表明BSH突变体的三级结构更紧凑,蛋白折叠性降低,表面疏水性降低,热稳定性提高。5.BSH对细胞胆盐响应进程的影响比较分析了BSH对胆盐胁迫条件下细胞生理活性的影响,发现BSH表达菌株会在原始菌株的胆盐应答基础上通过提高菌体表面疏水性、降低细胞膜流动性、调节膜蛋白表达丰度、缓解胞内p H的下降、增强FoF1-ATPase活性、增加ATP消耗、缓解碳氮代谢下降的水平、增强ADI途径的产氨水平来增强自身的胆盐抗性;通过比较BSH突变株与野生型BSH对细胞生理活性的调节作用,发现BSH突变体表达菌株的细胞膜纵向扩散下降程度低于野生型BSH1的表达菌株,进而调节一系列与此相关的响应进程来进一步提高细胞胆盐抗性。