论文部分内容阅读
本研究主要针对干酪乳杆菌GL-B胆盐水解酶产酶条件进行优化实验,从而提高胆盐水解酶的活力。以MRS肉汤培养基为基础培养基,考察了培养基组成对GL-B菌株产胆盐水解酶活力的影响。对产胆盐水解酶的最适碳源、氮源、培养温度、pH值、培养时间、刺激因子、接种量作了单因素实验,得出了最适条件。针对主要影响胆盐水解酶活力的五个因素,采用五因素四水平L16(45)的正交试验确定了提高胆盐水解酶活力的优化发酵条件是葡萄糖的添加量为2%,胰蛋白胨的添加量为1%,培养温度为37℃,pH值为7,接种量为2%。在MRS普通培养基中胆盐水解酶的酶活是0.543U,在此优化条件下胆盐水解酶活力是3.114U,比优化前提高了约5倍。为了进一步提高胆盐水解酶的活力,本实验还通过底物诱导方法来提高胆盐水解酶的活力,即以牛磺胆酸钠为底物诱导,最大可诱导胆盐水解酶酶活提高3.46倍。本实验还对干酪乳杆菌GL-B降胆固醇机理作了简单的研究。将干酪乳杆菌GL-B接种在含胆固醇和胆盐的MRS液体培养基中,并以未接菌的培养基为空白对照,培养24小时测定培养基中胆固醇的含量变化。结果表明,干酪乳杆菌GL-B有较强的降胆固醇的能力,对胆固醇的去除率为36.9%。通过干酪乳杆菌GL-B对胆固醇的去除过程和胆固醇在相应固液相中分布情况的实验分析表明,培养基中胆固醇的降低一部分归因于胆盐在胆盐水解酶作用下降解,胆固醇与降解的胆盐发生了共沉淀；另一方面是细胞对胆固醇的吸收,从而降低培养基中胆固醇的水平。胆盐水解酶的分离提纯主要包括：硫酸铵沉淀、阴离子交换树脂层析和SEPHADEXG-100凝胶层析。实验结果表明,当硫酸铵饱和度达到50%时,沉淀中酶的含量达到最大。采用阴离子树脂层析时,用0.1mol/L～0.5mol/LNaCl缓冲液进行洗脱,浓度为0.1mol/L的NaCl可以将胆盐水解酶洗脱下来,最后再通过SEPHADEX G-100层析。经过纯化后的样品电泳图只显示一条蛋白带,分子量大约是50kDa。胆盐水解酶性质研究实验,得出以下结论：胆盐水解酶最适pH为6.0；最适反应温度为37℃；最适底物浓度为6mmol/L; EDTA对酶活的抑制力最小,抑制率为6.25%,尿素对酶活力的抑制最大,抑制率为93.75%。