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目的对两例马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)患者的原纤维蛋白-1(fibrillin-1,FBN1)基因进行突变筛查和分析,探讨和明确相应患者的患病原因,并可为家系成员的症状前诊断和将来可能需要的产前诊断提供依据,为FBN1基因突变的致病性突变作出新的补充,为MFS的基因诊断和基因治疗提供新的视角。第一部分:FBN1基因同义突变导致马凡综合征的鉴定和分析方法1.提取MFS患者及其家系成员的基因组DNA,用第二代测序技术(Next generation sequencing,NGS)对FBN1基因进行突变筛查,并进行生物信息学分析。对筛查结果用Sanger测序进行验证。2.提取患者主动脉组织的RNA进行RT-PCR和Sanger测序,进一步验证NGS测序的结果。3.将患者的突变基因片段以及正常对照插入pcDNA3.1Myc-His C质粒中,并转染入Hela细胞,提取患者和正常对照的RNA,然后采用RT-PCR技术分析其剪接产物的表达情况。结果1.通过NGS测序筛查出1例MFS患者FBN1基因第39号外显子存在杂合的同义突变(c.4773A>G),Sanger测序验证结果与其一致。利用生物信息学预测软件分析该同义突变导致一个剪接位点的消失。丢失的剪接位点为5’-tgtcctggagGGGAAGGTTT-3’。第39号外显子两头的剪接位点预测分数没有改变。2.通过提取患者主动脉组织RNA并进行RT-PCR测序后显示,FBN1基因39号外显子产生跳读,从而使38号外显子和40号外显子直接连接。3.构建患者和正常对照的FBN1基因38-40号外显子片段的重组质粒,并且转染Hela细胞,提取RNA,做RT-PCR并测序后,其结果与主动脉组织的测序结果一致,即FBN1基因39号外显子的跳读。第二部分:一例马凡患者及其家系的FBN1基因大片段缺失的鉴定和分析方法1.提取先证者外周血DNA,用NGS对FBN1基因进行突变筛查,用多重连接依赖性探针扩增技术(multiple ligation dependent probe amplification,MLPA)技术检测FBN1基因缺失片段。2.对先证者及其家系成员的FBN1基因进行长片段PCR扩增,然后进行Sanger测序,并做正常对照,进一步验证缺失突变。结果先证者NGS测序结果显示FBN1基因66号外显子缺失突变,MLPA检测提示66号外显子缺失,Sanger测序结果显示FBN1基因65号内含子的后905bp和66号外显子的前511bp共1416bp片段缺失。先证者的妹妹和儿子具有相同的突变。结论1.FBN1基因的同义突变(c.4773A>G)是第一例MFS患者的致病原因。该突变导致其剪接位点的改变,导致第39号外显子跳读。2.由FBN1基因同义突变引起的剪接位点突变,能够导致MFS疾病的产生。3.FBN1基因65号内含子和66号外显子的长片段缺失是第二例MFS患者及家庭成员的致病原因。