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USP11是去泛素化酶中泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitin-specific proteases,UPS）成员之一。全长包含920个氨基酸,N端含有DUSP结构域（domain present in ubiquitin specific proteases,DUSP）和UBL结构域（ubiquitin-like domain,UBL）,C末端为催化结构域,其中包括第二个UBL结构域。在细胞内,USP11通过去泛素化作用稳定多种底物蛋白,如BRCA2、ALK5、IκBα、PML、γH2AX、RanBPM等,参与细胞信号转导调控,DNA损伤修复,并影响细胞的增殖和侵袭转移。但是,目前研究表明,USP11在不同类型的肿瘤细胞中,发挥的功能不同。在神经胶质瘤中,USP11通过去泛素化并稳定PML,抑制神经胶质瘤的增殖、迁移和侵袭。在乳腺癌中,USP11通过稳定XIAP而促进乳腺癌细胞的增殖。然而,至今USP11与非小细胞肺癌（NSCLC）的关系仍然未阐明。p21是第一个被鉴定的细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CKI）,属于CIP/KIP家族成员,介导细胞周期停滞、DNA复制与修复、增殖与分化、衰老与凋亡等重要细胞生命活动的调控。p21由CDKN1A基因编码,蛋白全长164个氨基酸。p21通过对CDKs活性的精确调节在确保细胞周期有序运行中发挥重要的作用,它的表达受转录和转录后机制的严密调控。在转录水平,p21通常以p53依赖和p53非依赖的方式被调控。在分裂细胞中,p21是一种非常不稳定的蛋白,半衰期仅有20-60分钟,主要通过泛素-蛋白酶体通路降解。目前研究表明有三种E3泛素连接酶复合物包括SCFSKP2、CRL4CDT2和APC/CCDC20参与细胞周期不同时相对p21的降解。在G1/S期,SCFSKP2促进Ser130位点被CDK2磷酸化的p21的泛素化降解。在S期,CRL4CDT2特异性靶向与PCNA结合的p21,导致p21的泛素化降解。在G2/M期,APC/CCDC20识别与CDK1-cyclin A和CDK1-cyclin B结合的p21并负责p21泛素化降解。E3泛素连接酶复合物中的SKP2、CDT2和CDC20蛋白在功能上是作为底物识别亚单位,充当p21与E3泛素连接酶复合物其它部分的连接桥梁。另一方面,研究也发现细胞内多个蛋白能通过不同的机制稳定p21,如p38和JNK通过磷酸化p21促进p21稳定;WISp39、hSSB1和TRIM39经蛋白相互作用稳定p21;Ras通过促进p21-cyclin D1复合物的形成稳定p21;Cabels1通过干扰PSMA3与p21的结合而促进p21稳定。但是这些蛋白都不具有任何去泛素化酶的活性和功能,在细胞内是否存在去泛素化酶,能够直接逆转p21泛素化过程至今仍然不清楚。本文通过质谱数据和数据库分析,发现USP11和p21可能存在相互作用。为了进一步验证两者的相互关系,我们采用间接免疫荧光染色技术发现USP11与p21存在共定位,免疫共沉淀及体外蛋白直接孵育等实验发现USP11免疫沉淀物中均可检测到p21,这些实验证明USP11与p21存在直接相互作用。p21是非常不稳定的蛋白,能被不同的E3泛素连接酶泛素化,进而通过蛋白酶体降解。考虑到USP11作为去泛素化酶的特征以及USP11与p21的相互作用关系,我们检测USP11对p21蛋白水平和mRNA水平的影响。通过在A549、HCT116和HCT116p53-/-中过表达USP11,发现内源性p21显著增加,而抑制USP11的表达能下调p21,且USP11对p21的调控呈剂量依赖性并依赖于USP11的去泛素化酶活性。然而,改变USP11表达对p21的mRNA水平没有影响,表明USP11对p21的调控发生在翻译后修饰水平。细胞内80%的蛋白主要通过蛋白酶体途径降解,为了证明USP11是否调控p21的泛素蛋白酶体途径降解,通过蛋白酶体特异性抑制剂阻断p21泛素化降解,明确USP11是通过蛋白酶体途径影响p21的泛素化降解。通过放线菌酮CHX抑制新生蛋白的合成进一步发现敲低内源USP11的表达能明显缩短p21的半衰期,而过表达野生型USP11使p21的半衰期延长,说明USP11能增强p21的蛋白稳定性。体内和体外泛素化实验进一步证明USP11能直接对p21进行去泛素化,主要移除K48连接的多聚泛素链。由于p21在细胞周期不同阶段分别由不同的E3泛素连接酶介导其泛素化降解,为了明确USP11在细胞中主要抵抗哪种E3泛素连接酶的作用,我们通过泛素化分析和细胞周期同步化实验,发现USP11能抵抗SCFSKP2、CRL4CDT2和APC/CCDC20三种E3连接酶复合体对p21的泛素化降解,表明USP11对p21的稳定性调控是不依赖于细胞周期的。p21作为细胞周期素依赖性激酶抑制子,介导细胞周期G1/S和G2/M期的调控。鉴于USP11能去泛素化稳定p21,为了证明USP11是否通过p21调控细胞周期的演进,我们通过细胞周期分析和细胞周期同步化实验,发现在p21正常表达的细胞中,干扰USP11表达能诱导细胞周期S期显著增加,而p21缺失的细胞中,USP11表达的改变对细胞周期无明显影响。在遭受DNA损伤时,USP11通过p21调控细胞周期G2/M期转换。以上实验说明USP11可通过p21调控细胞周期运转。细胞核中p21的主要功能是作为细胞周期负性调控因子,抑制细胞周期运转和肿瘤增殖。考虑到USP11与p21在NSCLC细胞系A549的细胞核存在共定位,我们检测USP11对NSCLC增殖是否存在影响。通过细胞实验和动物实验,发现USP11通过去泛素化稳定p21抑制非小细胞肺癌的增殖。免疫组化实验进一步证明USP11与p21表达水平在非小细胞肺癌临床样本中呈明显的正相关。综上所述,本论文首次明确p21是去泛素化酶USP11的重要底物蛋白,USP11能够直接结合p21,并去泛素化稳定p21。明确了USP11通过p21参与细胞周期G1/S和G2/M期的调控,从而介导NSCLC细胞增殖的分子机制。进一步拓宽我们对细胞周期调控理论的认识,将为NSCLC的靶向治疗、优化抗肿瘤治疗措施提供科学基础。