论文部分内容阅读
细胞自噬是真核细胞内一套高度保守的降解系统,它能够清除毒害性质的蛋白堆积物、衰老的线粒体以及侵染机体的病原微生物。根据其类型,自噬可以划分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三种形式。巨自噬,也就是常规意义上的自噬,它会形成双层膜结构包裹底物的自噬体,随后自噬体与溶酶体进行融合,在溶酶体中酸性水解酶的作用下将底物降解。在哺乳动物细胞中,一系列与酵母同源的自噬相关蛋白(ATG)组装成自噬复合体精细操控自噬的过程。自噬在细胞和生理水平的生物学过程中都发挥至关重要的作用,此外,自噬相关蛋白不但在自噬过程中起作用,而且还参与免疫反应的调节,例如:炎症、抗病毒反应、抗原加工和抗原递呈。自噬的主要激活剂能够抑制m TOR(mammalian target of rapamycin)信号从而启动自噬。m TOR信号通路中的关键受体m TORC1复合体抑制ULK1、ATG13、ATG101和FIP200组成的ULK1复合体的活性;而诱导细胞自噬的各种信号能够通过抑制m TORC1的活性,从而激活ULK1复合体,造成自噬的启动,进一步激活下游的Beclin-1复合体。Beclin-1复合体由Beclin-1、VPS34、VPS15以及ATG14L组成。Beclin-1复合体的活化导致VPS34催化产生磷脂酰肌醇3磷酸,后者对于自噬体的膜的成核是必需的。除此之外,在葡萄糖缺失的饥饿条件下,AMPK可以直接磷酸化Beclin-1从而激活VPS34。Beclin-1是激活VPS34活性进而引发自噬过程的信号中心。基于Beclin-1在细胞自噬中的核心地位,研究Beclin-1的翻译后水平的调控显得尤为重要。以往对Beclin-1的研究都集中在磷酸化修饰,对于Beclin-1的泛素化修饰,我们目前还知之甚少。泛素(ubiquitin)是具有76个氨基酸的高度保守序列的多肽,它们主要在一系列泛素连接酶(E1,E2和E3)的作用下,通过一个或者多个赖氨酸残基连接到蛋白上,从而形成泛素链。泛素化与去泛素化调控蛋白质的多种生物学功能,包括蛋白质的降解、DNA修复、染色质重排、细胞周期调控、内吞和激活级联信号通路等。最近的研究揭示泛素化修饰参与了自噬信号通路的调控。例如,TRAF6通过介导Beclin-1的K63连接的泛素化抑制Beclin-1与Bcl-2的相互作用;TRAF6还可以和AMBRA1协同作用,通过介导ULK1的K63泛素化,促进ULK1的寡聚化和稳定。此外,最新的一项研究通过大规模的si RNA筛选系统,揭示了将近一半的TRIM蛋白参与自噬的激活,它们能够与自噬相关蛋白相互作用,为ULK1和Beclin-1的组装提供平台;并且该课题组还鉴定出TRIM5α能够作为一个选择性自噬受体,直接靶向病毒核衣壳蛋白,将后者运输到自噬溶酶体进行降解。随着研究的深入,泛素化修饰对细胞自噬的调控网络逐渐显现,但是自噬核心分子的具体泛素化模式和调控作用还有待于进一步阐明。考虑到泛素化修饰涉及细胞中自噬的调控,我们猜想细胞需要一些去泛素化酶蛋白参与细胞自噬的调节。在本项研究中,我们成功筛选出USP19作为一个去泛素化酶蛋白正调控自噬过程,并且对USP19在自噬和抗病毒反应中的cross talk进行了系统研究,其主要结果如下:1、筛选和鉴定了USP19的促进细胞自噬的功能。我们通过对去泛素化酶蛋白家族的筛选,发现USP19作为一个正调控因子参与自噬过程,并通过一系列实验确认了USP19的促进细胞自噬的功能。2、USP19能够结合Beclin-1分子。过量表达和内源性实验都证明了USP19能够与Beclin-1相互作用,而且这种相互作用的强度随着自噬过程的启动而增加。3、USP19促进Beclin-1蛋白的稳定性。USP19可以特异性地参与Beclin-1复合体中Beclin-1稳定的调节。USP19通过一种不依赖USP13的方式抑制Beclin-1通过蛋白酶体途径的降解,并且USP19发挥作用是依赖自身的酶活性的。4、USP19去除Beclin-1的K11连接的泛素化修饰。USP19能够切除Beclin-1蛋白上的K11连接的泛素链,并且USP19通过其去泛素酶活性调节Beclin-1的K11连接的泛素化修饰。5、Beclin-1的K437位点对自身的稳定是必需的。我们进一步发现USP19影响Beclin-1上锚定的K11连接的泛素链。Beclin-1上K437位点可以发生K11连接的泛素化修饰。抑制K437位点的K11连接的泛素化修饰能够抑制Beclin-1的降解,并且增强细胞内自噬的发生。6、USP19负调控RNA病毒激活的I型干扰素反应。USP19能够特异性地抑制RIG-I激活的I型干扰素信号通路,而且USP19负调控I型干扰素信号通路是不依赖于自噬途径的。7、Beclin-1抑制RIG-MAVS作用。Beclin-1自身能够作为RIG-I介导I型干扰素信号的负调控因子。Beclin-1抑制I型干扰素信号通路是通过结合到MAVS的CARD上,从而阻断RIG-I与MAVS的相互作用实现的。USP19通过促进Beclin-1蛋白的稳定,也能抑制RIG-I-MAVS相互作用,从而负调控RNA病毒激活的I型干扰素产生。本研究揭示了USP19参与Beclin-1泛素化调控的新机制,证明了K11连接的泛素链作为Beclin-1的降解信号。USP19通过消除这种泛素化信号而保护Beclin-1不被降解,被USP19稳定的Beclin-1一方面可以促进细胞内自噬体的形成并且增强自噬流的进程;另一方面,Beclin-1通过阻断RIG-I和MAVS的相互作用从而抑制RNA病毒激活的I型干扰素信号通路。USP19参与的自噬和抗病毒反应的cross talk研究,为今后抗病毒药物的开发提供了很好的理论基础。