鞘糖脂是广泛存在于真核生物细胞膜表面的成分,参与人体细胞分化、细胞免疫、细胞凋亡等多种生命活动。鞘糖脂内切糖苷酶EGCaseⅡ可以特异性水解鞘糖脂中神经酰胺与寡糖之间的β-糖苷键,从而释放出神经酰胺和寡糖链。同时,将其亲核残基Glu351改造为Ser351,可以将其转变为糖苷合成酶。这种双功能的特性使得EGCaseⅡ在鞘糖脂组学分析及鞘糖脂药物合成中有着重要应用。然而,天然EGCaseⅡ的催化活性低、底物谱窄,限制了其广泛应用。本论文尝试利用分子设计手段对野生型EGCaseⅡ进行改造。首先,用半理性设计方法进行突变库设计,用结构叠加方法将鞘糖脂底物GM1定位到EGCaseⅡ中,选取距离底物5（?）的位点构建饱和突变库,利用HPLC对突变库进行筛选,获得了水解GM1活性提高的突变体D311S、D311E、D311G、D311A、D311V、I276V、I276L,活性提高1.5-6.9倍。进一步将这些阳性突变点与前期获得的S63G位点进行组合,获得的最优突变体S63G/D311E对GM1的水解活性比野生型EGCaseⅡ提高25.3倍,酶动力学表征显示,S63G/D311E的Km由0.17 m M降低到0.06 m M,kcat由5.5 min-1增大到50.3 min-1。底物谱表征显示,以GM3为底物,对上述单点突变进行组合,获得的最优突变体I276L/D311V的活性比野生型提高了11.8倍。对酶-底物复合物模式结构进行分析表明,Ile276与Asp311都位于底物结合口袋附近,对其进行突变可能使活性中心的微环境发生改变,有利于酶与底物的结合,从而提高酶活性。当前,E351S/D314Y为迄今报道的合成活性最高的鞘糖脂内切糖苷合成酶突变体,为了提升鞘糖脂内切糖苷合成酶EGCaseⅡ的活性,将实验室前期通过理性设计获得的水解活性提高的突变点S63G与E351S/D314Y进行组合,构建了新的合成突变体E351S/S63G/D314Y,以D-sphingosine和lactose-F为底物,测活验证发现E351S/S63G/D314Y相对于E351S/D314Y提高了2倍。随后,将此突变体应用于神经节苷脂GM1前体lactosyl sphingosine的催化体系中,对催化体系中的温度、p H、酶浓度、反应时间进行参数优化。结果表明,在反应温度为45 oC,p H4.0,酶浓度4.8 mg/m L,反应时间180 min时,此时产物积累量最大,可达到27.9 g/L,转化率接近90%,为实现神经节苷脂GM1的大规模合成提供重要的技术支撑。综上所述,本论文围绕EGCaseⅡ的水解活性以及合成活性进行了研究。一方面,筛选并表征了水解活性较高的突变体,为研究该酶的催化机制提供了重要依据,为今后进一步进行疾病标志物检测以及新药研发开拓新的思路。另一方面,获得了合成活性较高的合成突变体,通过参数优化使其达到较高的产量和转化率,为实现神经节苷脂类药物的大规模生产提供了优质的酶源。