【摘 要】
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心肌肥厚是心肌对血流动力学过载和神经激素刺激的反应过程,若负荷的压力或刺激不去除,这种适应性肥厚通过病理重塑可转变为心力衰竭。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）是一类长度约为20-22 nt的内源性非编码RNA,参与了心肌肥厚的发生、发展进程。目前的研究主要关注细胞质中miRNAs的生物学功能,而细胞核中miRNAs的作用及其分子机制尚未阐明。目的:本文旨在探讨胞核内miR-199b
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心肌肥厚是心肌对血流动力学过载和神经激素刺激的反应过程,若负荷的压力或刺激不去除,这种适应性肥厚通过病理重塑可转变为心力衰竭。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）是一类长度约为20-22 nt的内源性非编码RNA,参与了心肌肥厚的发生、发展进程。目前的研究主要关注细胞质中miRNAs的生物学功能,而细胞核中miRNAs的作用及其分子机制尚未阐明。目的:本文旨在探讨胞核内miR-199b-5p对心肌肥厚的调控作用及分子机制。方法:1.RT-qPCR检测人心衰心肌及异丙肾上腺素（ISO）诱导的小鼠肥厚心肌中miR-199b-5p的表达水平;2.在明确肥大相关基因表达上调的血管紧张素II（Ang II）诱导的乳小鼠心肌细胞肥大模型中,检测miR-199b-5p的表达水平;3.进行细胞核、质RNA组分分离,明确miR-199b-5p的亚细胞分布情况;4.利用RNAscope实验验证miR-199b-5p的亚细胞定位;5.使用miR-199b-5p mimic在乳小鼠心肌细胞（NMVCs）中过表达miR-199b-5p,利用RT-qPCR及Western Blot检测miR-199b-5p对心肌细胞肥大表型的影响;6.双萤光素酶报告基因实验验证miR-199b-5p与细胞周期蛋白依赖性激酶9（Cdk9）基因启动子之间的结合及对Cdk9基因的转录激活作用;7.Ch IP-PCR实验验证miR-199b-5p通过招募p300与RNA聚合酶II（Pol II）对Cdk9基因产生转录激活作用;8.构建重组Cdk9腺病毒（r Ad-CDK9）,明确过表达CDK9对心肌细胞肥大表型的影响;9.利用小干扰RNA（si RNA）敲减NMVCs中CDK9的表达,通过鬼笔环肽染色和Western blot检测敲减CDK9对miR-199b-5p促心肌细胞肥大作用的影响;10.检测过表达CDK9对NMVCs中磷酸化GATA4（p-GATA4）水平的影响;11.进行蛋白核质组分分离,明确过表达CDK9或miR-199b-5p后对CDK9与GATA4核质分布的影响;12.利用agomiR-199b-5p与CDK9 si RNA（si-CDK9）干预小鼠心肌肥厚模型,检测心功能及心肌肥厚相关蛋白的表达。结果:1.麦胚凝集素（WGA）染色显示心衰时心肌细胞明显肥大,RT-qPCR结果显示miR-199b-5p表达显著增加;2.Ang II诱导乳小鼠心肌细胞肥大模型中,miR-199b-5p上调表达;3.RT-qPCR结果显示miR-199b-5p在胞核、胞质中均有分布;4.将miR-199b-5p mimic转入乳小鼠心肌细胞后,miR-199b-5p在胞核中的表达增多;5.miR-199b-5p具有促心肌细胞肥大和增强心肌肥厚相关基因表达的作用;6.双萤光素酶报告基因实验证实miR-199b-5p与Cdk9基因启动子之间存在结合作用,miR-199b-5p可以转录激活Cdk9表达;7.Ch IP-PCR实验证实miR-199b-5p通过招募p300与Pol II参与对Cdk9基因的转录激活作用;8.过表达CDK9后,心肌细胞肥大相关蛋白表达增加,而敲减CDK9可逆转miR-199b-5p的促心肌细胞肥大作用;9.利用r Ad-CDK9过表达CDK9可特异升高NMVCs中p-GATA4水平,进而介导心肌肥大相关基因表达;10.过表达CDK9或miR-199b-5p均可引起核内CDK9表达增多,并促进GATA4入核;11.在整体动物水平,心脏B超及Western blot结果显示miR-199b-5p可导致小鼠心功能下降、加重心肌肥厚,沉默Cdk9则可逆转这一现象。结论:微小RNA miR-199b-5p在心肌肥厚时表达增加,核内miR-199b-5p可转录激活Cdk9基因表达,进而激活GATA4信号发挥促心肌肥厚的作用。
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