论文部分内容阅读
[背景与目的]肿瘤恶性生物学行为与其特殊的物质能量代谢密切相关,异常的物质能量代谢已成为肿瘤细胞新的生物学特性并越来越受到关注。锌-α2-糖蛋白（Zinc-α2-glycoprotein,ZAG）基因定位于染色体7q22.1,其编码42kDa的分泌性蛋白,体内实验证实ZAG能强烈促进脂肪分解,多种肿瘤中ZAG表达常下调,而脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FASN）与哺乳动物雷帕霉素（Mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路活性常上调,另有报道称FASN、Akt/mTOR信号通路参与多种肿瘤细胞的物质能量代谢,但三者在肠癌细胞物质能量代谢过程中的相互作用机理并不清楚。本研究旨在探讨ZAG与FASN交互作用对肠癌细胞恶行生物学行为的影响及其作用机制。以期进一步明确相关分子在大肠癌发病过程中的作用,为大肠癌的分子诊断和靶向治疗提供实验依据。[方法]1. RT-PCR与Western blot检测肠癌细胞系LoVo/HT-29/Caco-2/HCT-116中ZAG基因及蛋白的表达,选取ZAG表达低的细胞株作为后续实验的靶细胞。2.构建ZAG过表达质粒及其空载质粒,转染靶细胞株,观察转染效率,RT-PCR与Western blot检测转染后ZAG基因及蛋白表达。3. RT-PCR检测转染前后LoVo细胞FASN、mTOR、Akt等相关信号通路基因的表达;Western blot检测转染前后LoVo细胞FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相关信号通路蛋白的表达。4.检测过表达ZAG质粒及其空载质粒转染靶细胞后ATP水平的变化,并检测各组细胞上清中乳酸水平改变,研究ZAG对肠癌细胞能量代谢的影响。5. MTT增殖实验、克隆形成实验以及Transwell实验检测ZAG过表达对肠癌细胞株增殖、侵袭和迁移能力的影响,使用碘化丙啶（Propidiumiodide,PI）标记各组靶细胞,流式细胞术检测转染ZAG前后靶细胞细胞周期的变化。6.不同浓度(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 11μM, 10μM的FANS特异性浅蓝菌素（Cerulenin）作用于肠癌细胞HT-29和LoVo细胞株,药物毒性实验检测浅蓝菌素对肠癌细胞的半数抑制浓度（Inhibitory concentration of 50%,IC50）。7. QRT-PCR和Western blot检测Cerulenin处理组、DMSO对照组和空白组细胞中ZAG、FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相关分子的表达。8.使用Cerulenin处理HT-29和LoVo细胞,检测处理组和对照组细胞中ATP水平及培养基中乳酸变化,观察Cerulenin对各组肠癌细胞能量代谢的影响。9.细胞克隆形成实验、Transwell小室实验检测Cerulenin对各组肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,流式细胞术检测Cerulenin对LoVo和HT-29细胞细胞凋亡的影响。[结果]1. RT-PCR结果显示,与HT-29/Caco-2/HCT-116肠癌细胞相比,LoVo细胞中ZAG基因相对表达最低（0.46±0.05） （P<0.05）,Western blot检测4株肠癌细胞中ZAG蛋白的表达,结果提示LoVo细胞中ZAG蛋白相对表达（0.43±0.05）最低（P<0.05）,因此本章实验选取LoVo细胞作为靶细胞。2.使用pGCMV/EGFP/Neo /ZAG质粒及其空载质粒转染LoVo细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达情况,实验组与空载质粒组均有较高的转染效率,使用抗性基因成功筛选稳定转染细胞株,RT-PCR证实转染pGCMV/EGFP/Neo/ZAG质粒后的LoVo细胞ZAG基因相对表达增加（0.65±0.05）（P<0.05）,Western blot显示与其它对照组相比实验组ZAG蛋白相对表达增加（0.67±0.06）（P<0.05）。空载质粒组和空白组ZAG表达无差异（P>0.05）。3. RT-PCR结果显示;与空载质粒组和空白组相比,转染ZAG质粒的LoVo细胞中FASN基因相对表达（0.55±0.08）下调（P<0.05）,但mTOR基因（0.81±0.06）与Akt基因（0.78±0.06）相对表达与对照组相比无统计学差异;Western blot结果显示,与空载质粒组和空白组相比,转染过表达ZAG质粒的LoVo细胞FASN （0.61±0.06）、p-mTORser2448（0.53±0.08）和 p-Aktser473（0.58±0.10）相对表达下调（P<0.05）,t-mTOR（0.97±0.13）和t-Akt（0.83±0.14）相对表达无统计学差异（P>0.05）。4.与空载质粒转染组和空白组相比,转染过表达ZAG质粒的LoVo细胞内ATP含量（611.23 ± 97.37 mmol/grot）降低,细胞上清中乳酸的浓度（29.84 ±5.04 mmol/L）也同时降低（P<0.05）。5. MTT实验显示与空载质粒组和空白组相比,过表达ZAG的LoVo细胞的增殖能力（0.79±0.08）减弱;克隆形成实验结果显示实验组LoVo细胞细胞克隆形成率降低（4.38%±0.71%）; Transwell小室实验结果提示转染ZAG过表达质粒的LoVo细胞穿过半透膜的数量（64.33±8.02）明显减少;使用PI标记各组细胞,流式细胞术检测显示实验组LoVo细胞G2期的细胞比例（29.47%±2.03%）增高（P<0.05）。6.使用一系列Cerulenin浓度处理HT29和LoVo细胞48h后,二者增殖率分别是（82.34±5.38%, 74.78 ±9.44%, 66.21 ±4.37%, 60.16 ±9.95%, 38.05 ±8.26 %）和（83.45± 7.86 %, 75.05 ±9.11 %, 63.93 ± 4.48 %, 45.59 ± 11.42 %, 21.68 ± 6.87 %）,Cerulenin处理HT29和LoVo细胞的IC50分别是 1.93μM和0.37μM,使用此Cerulenin浓度和配对的DMSO浓度进行本部分后续实验。7. RT-PCR结果显示,经Cerulenin处理后的HT-29和LoVo细胞株ZAG基因（0.37±0.06和0.29±0.06 ）表达水平较空白组和DMSO组降低（P < 0.05）,mTOR基因（0.76±0.14和0.85±0.10）和Akt基因（0.64±0.06和0.78±0.08）相对表达与DMSO组和空白组相比无统计学差异;Western blot结果显示,与空白组和DMSO组相比,经Cerulenin处理的HT-29 和 LoVo 细胞株 FASN 表达（0.34±0.08 和 0.52±0.04）、ZAG（0.38±0.05 和0.21±0.04）、p-mTORser2448（0.42±0.03和0.44±0.01）和p-Aktser473（0.55±0.10和0.58±0.10）相对表达降低（P < 0.05）,但t-mTOR（0.90±0.10和0.88±0.10）和t-Akt相对表达（0.80±0.16和 0.85±0.11）无统计学差异（P > 0.05）。8.实验组HT29和LoVo细胞中ATP的含量（449.60 ± 94.81 mmol/grot 和 528.73 ± 37.43 mmol/grot）较DMSO组和空白组降低（P<0.05）,同时培养基中的乳酸水平（24.20 ±3.05 mmol/L 和 29.78 ± 2.10 mmol/L）也较DMSO组和空白组降低（P< 0.05）,DMSO组与空白组未见ATP或乳酸差异。9.实验组HT29和LoVo细胞克隆形成率降低（6.36%±1.07%和 11.16%±1.46） （P < 0.05）;同时FANS的抑制也诱导了HT29和LoVo细胞侵袭能力（80.33±12.40和96.67±16.27）的降低（P < 0.05）; Cerulenin诱导HT29和LoVo细胞凋亡率（37.41%±8.48% 和31.28%±3.98%）增加。[结论]1. ZAG过表达质粒构建并成功转染入LoVo细胞,过表达ZAG可抑制Akt/mTOR通路活性,进而抑制FASN的表达,最终阻滞肿瘤细胞恶性生物学行为（细胞增殖、侵袭能力、凋亡和细胞周期）及能量代谢。2. FASN的抑制导致Akt/mTOR通路活性降低,进一步影响ZAG的表达,最终阻滞肠癌细胞恶性生物学行为（细胞增殖、侵袭能力、凋亡和细胞周期）及能量代谢。3. ZAG与FASN交互作用可调节肠癌细胞的能量代谢及其恶行性,且此过程可能由Akt/mTOR信号通路介导。