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1、子宫颈癌辐射抗性相关基因的筛选、分析验证及临床研究研究目的:子宫颈癌作为女性生殖系统最常见的恶性肿瘤,位居世界女性癌症第四位。目前,子宫颈癌在中国的发病率与死亡率依然呈上升趋势且趋于年轻化。虽然早期（IA1、IA2）子宫颈癌可通过手术治愈,但放射治疗（放疗）仍然是子宫颈癌治疗的基石。然而,辐射抗性是子宫颈癌放疗有效性的关键影响因素,因此,克服辐射抗性,对于子宫颈癌患者获得更好的治疗效果意义重大。目前临床工作中仍没有针对子宫颈癌辐射抗性的生物标志物。KLK5（kallikrein-related peptidase5）是激肽释放酶（kallikrein-related peptidases,KLKs）家族中重要一员,在肿瘤发生发展中发挥着多种作用,且本研究初期发现KLK5可能参与宫颈癌辐射抗性的形成过程。因此,本论文的临床研究目的是在筛选出子宫颈癌辐射抗性相关基因的基础上,进一步证实KLK5对辐射抗性的重要性,解析KLK5与子宫颈癌放疗临床疗效、患者SCC水平、患者免疫状态以及远期预后的相关性。研究方法:（1）样本收集:将2014-2016年期间吉林大学第二医院收治的19例原发性鳞状细胞子宫颈癌患者分为两组:放疗敏感组（radiotherapy-sensitive group,RS,13例）和放疗抗拒组（radiotherapy-resistant group,RR,6例）;（2）c DNA文库构建;（3）微阵列分析,绘制散点图、火山图、热图,并进行GO富集分析及KEGG分析;（4）RT-q PCR和Western blot验证KLK5在RR组和RS组组织标本中的表达量差异,并进行统计学分析;（5）统计分析患者放疗前血SCC结果、放疗前和放疗后6个月血液免疫指标差异（CD3+CD4+/CD3+CD8+）;（6）统计分析患者放疗前肿瘤体积大小差异;（7）RECIST分析评估患者实体肿瘤转归结果。研究结果:（1）组织高通量测序及生物信息学分析结果显示KLK5在RR组和RS组中表达差异最显著（P＜0.001）;（2）RT-qPCR和Western blot验证结果显示RR组肿瘤组织中KLK5的表达量较RS组极显著上调（P＜0.01）;（3）放疗前RR组血SCC水平显著高于RS组（P＜0.05）;（4）RS组患者免疫状态恢复情况显著优于RR组患者（P＜0.05）;（5）放疗前RR组的肿瘤体积显著大于RS组（P＜0.05）;（6）RS组患者中4例疾病进展,1例部分缓解,1例疾病稳定;RS组患者仅1例部分缓解,余患者均完全缓解。研究结论:KLK5高表达患者放疗前SCC水平较高、肿瘤体积较大,且免疫状态恢复欠佳。同时,KLK5高表达的患者与KLK5低表达患者比,宫颈病灶持续存在,表现出了强辐射抵抗,导致患者预后不良。2、KLK5调节子宫颈癌细胞辐射抗性作用机制的研究研究目的:研究证实KLK5不仅可通过激活生长和分化信号通路来促进肿瘤增殖,还可以切割细胞外基质成分,造成癌细胞对临近组织的侵袭以及癌细胞的远处转移。基于此,本部分研究内容通过体外子宫颈癌细胞实验,进一步探讨KLK5对子宫颈癌细胞辐射抗性影响的相关机制。研究方法:（1）5种子宫颈癌细胞系中,筛选出KLK5高表达和低表达的细胞系,并建立KLK5稳转沉默细胞系（sh-KLK5）和过表达细胞系（OE-KLK5）;（2）Western blot和CCK-8实验筛选出最佳辐射剂量及时间点;（3）克隆形成实验、细胞免疫荧光实验、Transwell小室实验、细胞划痕实验以及流式细胞术（细胞周期和凋亡检测）,检测KLK5对子宫颈癌细胞辐射抗性的影响;（4）Western blot检测与细胞增殖、侵袭迁移、周期和凋亡等相关通路的关键蛋白质表达量变化（PCNA、MMP9、Cyclin B1、Bax、Bcl-2）;研究结果:（1）建立了KLK5稳转沉默细胞系MS751-sh-KLK5和KLK5稳转过表达细胞系ME180-OE-KLK5;（2）MS751细胞沉默组、空白组及阴性对照组最佳辐射剂量及时间点为:4Gy-48h;ME180细胞过表达组、空白组及阴性对照组为:6Gy-48h;（3）克隆形成实验、细胞免疫荧光实验、Transwell小室实验、细胞划痕实验以及流式细胞术（细胞周期和凋亡检测）,证明了过表达KLK5显著增强了辐射诱导的子宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,抑制辐射诱导的子宫颈癌细胞G2/M期阻滞和凋亡;沉默KLK5显著抑制了辐射诱导的子宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进辐射诱导的子宫颈癌细胞G2/M期阻滞和凋亡;（4）Western blot结果显示,过表达KLK5增加了辐射诱导的子宫颈癌细胞中与细胞增殖相关的PCNA、与细胞侵袭迁移相关的MMP9、与抑制细胞凋亡相关的Bcl-2、与细胞周期相关的Cyclin B1蛋白质的表达量（P＜0.01）,同时抑制了与促进细胞凋亡相关的Bax蛋白质的表达量（P＜0.01）。而KLK5基因的沉默抑制了辐射诱导的子宫颈癌细胞中PCNA、MMP9、Bcl-2、Cyclin B1蛋白质的表达量（P＜0.01）,同时增加了Bax蛋白质的表达量（P＜0.01）。研究结论:KLK5增强辐射诱导的子宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,抑制辐射诱导的子宫颈癌细胞G2/M期阻滞及凋亡,即KLK5参与增强了子宫颈癌细胞辐射抗性。3、KLK5与X射线联合作用对子宫颈癌细胞裸鼠成瘤性影响的实验研究研究目的:在本章节中,通过构建人子宫颈癌细胞裸鼠移植瘤模型,进一步通过体内实验验证KLK5对子宫颈癌细胞辐射抗性的影响,并对其可能的分子机制进一步探索。研究方法:选用人子宫颈癌ME180细胞系及其稳转过表达和阴性对照细胞系,MS751细胞系及其稳转沉默和阴性对照细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,并分组观察疗效。分组情况如下:Ⅰ:（1）ME180-MOCK+0Gy组;（2）ME180-NC+0Gy组;（3）ME180-OE-KLK5+0Gy组;（4）ME180-MOCK+6Gy组;（5）ME180-NC+6Gy组;（6）ME180-OE-KLK5+6Gy组。Ⅱ:（1）MS751-MOCK+0Gy组;（2）MS751-NC+0Gy组;（3）MS751-sh-KLK5+0Gy组;（4）MS751-MOCK+4Gy组;（5）MS751-NC+4Gy组;（6）MS751-sh-KLK5+4Gy组。（1）绘制肿瘤生长曲线对比照射后各实验组移植瘤的大小;（2）免疫组化法检测各实验组移植瘤KLK5表达水平的变化;（3）免疫组化法检测各实验组移植瘤Ki67表达水平的变化;（4）移植瘤进行HE染色,评价KLK5对辐射抗性的影响;（5）Western blot检测各实验组移植瘤KLK5蛋白质表达量的变化。研究结果:（1）ME180-OE-KLK5+6Gy组移植瘤体积明显大于ME180-MOCK+6Gy和ME180-NC+6Gy组（P＜0.05）。MS751-sh-KLK5+4Gy组移植瘤体积明显小于MS751-MOCK+4Gy和MS751-NC+4Gy组（P＜0.05）;（2）ME180-OE-KLK5细胞移植瘤照射前后KLK5表达水平没有显著变化,ME180-MOCK-KLK5和ME180-NC-KLK5细胞移植瘤照射后KLK5表达水平显著下降。MS751-sh-KLK5细胞移植瘤照射后KLK5表达水平显著降低,MS751-MOCK-KLK5和MS751-NC-KLK5细胞移植瘤照射前后KLK5表达水平没有显著变化;（3）ME180-OE-KLK5+6Gy组移植瘤Ki67表达水平显著高于ME180-MOCK+6Gy和ME180-NC+6Gy组移植瘤。MS751-sh-KLK5+4Gy组移植瘤Ki67表达水平显著低于MS751-MOCK+4Gy和MS751-NC+4Gy组移植瘤;（4）ME180-OE-KLK5+6Gy组移植瘤坏死程度明显低于ME180-MOCK+6Gy和ME180-NC+6Gy组。而MS751-sh-KLK5+4Gy组移植瘤坏死程度较MS751-MOCK+4Gy和MS751-NC+4Gy组明显增加;（5）Western blot结果显示,ME180-OE-KLK5细胞裸鼠移植瘤照射前后KLK5蛋白质表达量没有显著变化,ME180-MOCK-KLK5和ME180-NC-KLK5细胞裸鼠移植瘤照射后KLK5蛋白质表达量显著下降（P＜0.05）。MS751-sh-KLK5细胞裸鼠移植瘤照射后KLK5蛋白质表达量显著降低（P＜0.01）,MS751-MOCK-KLK5和MS751-NC-KLK5细胞裸鼠移植瘤照射前后KLK5蛋白质表达量没有显著变化。研究结论:KLK5促进经X线照射的子宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长,抑制经X线照射的子宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的凋亡坏死,进一步证明KLK5参与并增强了子宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的辐射抗性。