研究背景:皮肤癌是一种常见的癌症形式,目前在世界范围内发病率不断上升。其中皮肤黑色素瘤和皮肤鳞状细胞癌是恶性程度最高、死亡率最高的两种皮肤恶性肿瘤。除传统的手术治疗方法外,近年来光动力治疗（PDT）在皮肤肿瘤的治疗中日益受到人们的关注。然而光动力治疗也存在一定的局限性,由于穿透深度不足,无法用于治疗体积较大的肿瘤。因此,打破光动力疗法的限制、突破皮肤肿瘤的治疗瓶颈迫在眉睫。声动力治疗（SDT）与PDT的原理相似,都是通过局部产生活性氧来进行抗肿瘤治疗,具有非侵袭性和精准性的特点。但声动力治疗中所需的超声波具有更深的组织穿透能力,因此在皮肤肿瘤的治疗领域具有潜在的应用前景。目前声动力治疗受到多方面因素的限制,例如（1）肿瘤细胞内高浓度的还原型谷胱甘肽（GSH）会形成还原性肿瘤微环境,减少声动力治疗过程中产生的活性氧;（2）缺少满足生物安全性的声敏剂。虽然目前已经有报道通过递送原卟啉（Pp IX）或血卟啉等有机声敏剂实现声动力治疗,但这些声敏剂往往具有光毒性,会给患者带来安全隐患。因此,设计并制备能改变肿瘤微环境,同时满足生物安全性的声敏剂对声动力治疗至关重要。通过化学反应来消耗GSH改善还原性肿瘤微环境的策略已经被广泛报道。最近有研究表明用于气体治疗领域的SO2作为一种氧化型气体分子可以与GSH反应,在降低细胞内GSH水平的同时增加细胞内的活性氧（ROS）的水平,不仅改善了还原性肿瘤微环境还实现了治疗的目的。5-氨基乙酰丙酸（ALA）是FDA批准的一种药物,可以在肿瘤细胞中更多的代谢合成原卟啉IX（Pp IX）,在特定光照下发挥抗肿瘤作用。ALA作为一种安全的PDT药物已经应用于多种皮肤相关疾病的治疗。当ALA用于局部给药时,由于其渗透性差、光穿透性有限,通常仅用于治疗表浅的皮肤肿瘤;当ALA用于系统给药时,由于小分子在体内清除快、难以在肿瘤部位蓄积,很难达到理想的治疗效果。幸运的是Pp IX作为SDT的声敏剂已经被广泛报道,我们预计将ALA作为声敏剂前药纳入纳米药物有望解决目前的应用困境,同时将为皮肤肿瘤的SDT提供了满足生物安全性的声敏剂。鉴于此,本论文中,我们拟将SO2和ALA结合,通过制备二合一纳米前药来发挥各自的优势。该前药利用纳米药物的增强渗透滞留（EPR）效应来增强肿瘤内的蓄积;利用SO2实现气体治疗并消耗GSH、调控还原性肿瘤微环境;利用ALA作为满足生物安全性的声敏剂经代谢合成Pp IX实现SDT。我们预期,该二合一纳米前药在抗肿瘤的同时还能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡、促进DC细胞成熟、增加肿瘤内部T细胞浸润,有望为皮肤恶性肿瘤的临床治疗提供新的思路。研究目的:将SO2和ALA各自的抗肿瘤优势融为一体,合成一种GSH响应性二合一前药小分子DOA,并通过自组装的方式制备成纳米前药P-DOA NPs。在材料水平和细胞水平探究该二合一纳米前药增强的SDT效果;在小鼠黑色素瘤和鳞状细胞癌模型中探究其P-DOA NPs的抑瘤效果及相关作用机制,并进一步探究该纳米前药引起的相关免疫反应,为皮肤恶性肿瘤的治疗提供新的策略。研究方法:1.通过DNs和ALA的偶联反应合成双前药小分子DOA;通过文献方法合成甲氧基聚（乙二醇）-b-聚（L-赖氨酸）（m PEG-b-PLL）;将DOA和m PEG-b-PLL共组装形成纳米粒子,通过调整二者比例制备并筛选出最理想的纳米粒子P-DOA NPs;通过~1H NMR、13C NMR和质谱共同验证DOA的成功合成;通过动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）验证P-DOA NPs的稳定性、大小和形貌;通过ICP-MS检测DOA的载药量和包封率;通过~1H NMR、DLS、Zeta电位和TEM图像的变化分别检测DOA和P-DOA NPs的还原响应性;通过SO2试纸和荧光探针分别定性定量检测SO2释放能力;通过GSH检测试剂盒检测P-DOA NPs的GSH消耗能力。2.体外实验:通过流式细胞术检测肿瘤细胞对P-DOA NPs的摄取;通过MTT实验检测纳米药物对B16F10和SCC细胞的体外抗肿瘤效果;通过凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡水平;通过激光共聚焦显微镜、紫外-可见光谱、酶标仪和流式细胞仪分别定性定量检测P-DOA NPs响应性释放ALA后代谢合成Pp IX的水平;通过DEACA探针检测细胞内SO2表达情况;通过GSH检测试剂盒和DCFH-DA探针分别检测细胞水平的GSH消耗和ROS生成情况;通过SOSG检测细胞水平~1O2的生成情况。3.体内实验:构建小鼠皮肤黑色素瘤模型,通过小鼠活体光声成像和离体器官组织荧光成像观察药物在各器官和肿瘤部位的蓄积并指导治疗;构建小鼠皮肤鳞状细胞癌模型,通过活体光声成像观察药物在肿瘤组织的蓄积并指导治疗;探究P-DOA NPs对小鼠皮肤黑色素瘤和小鼠皮肤鳞状细胞癌的体内抑瘤效果;通过肿瘤组织的H＆E、TUNEL染色和ROS染色探究体内抗肿瘤作用机制;通过GSH检测试剂盒检测P-DOA NPs在体内肿瘤组织中的GSH消耗能力;通过小鼠体重变化、主要器官H＆E染色和血清生化分析探究P-DOA NPs的体内安全性;通过对小鼠皮肤黑色素瘤模型抑瘤治疗后肿瘤组织及淋巴结中免疫细胞进行流式测试,探究纳米药物对系统免疫的激活和对免疫微环境的调控;研究结果:1.成功合成了双前药小分子DOA和高分子聚合物m PEG-b-PLL;在DOA和m PEG-b-PLL质量比为1:2时制备出P-DOA NPs;动态光散射法测得P-DOA NPs的粒径为109nm,TEM和SEM图像显示其为均匀分布的球形结构,并且在不同溶液中可稳定存在72h;ICP-MS测得P-DOA NPs的载药量为27%,包封率为55%;P-DOA NPs在硫醇作用下会失去球形结构,降解并释放出SO2和ALA,在120min时SO2的释放量可达90%左右;P-DOA NPs在6h后可消耗环境中约70%的GSH。2.体外实验:P-DOA NPs能够被内化进入肿瘤细胞并呈时间依赖性;MTT实验表明,在超声条件下P-DOA NPs对黑色素瘤肿瘤细胞和鳞状细胞癌细胞均有良好的抑瘤效果,并且主要通过诱发细胞凋亡的方式发挥作用;在细胞内GSH作用下不仅能响应性释放ALA并转化为Pp IX,还能释放SO2,经P-DOA NPs孵育6h后细胞内Pp IX含量最高;P-DOA NPs在6h后可消耗肿瘤细胞内约60%的GSH;P-DOA NPs在超声作用下能有效提高肿瘤细胞内ROS水平,其种类为~1O2。3.体内实验:活体光声成像和离体荧光成像结果显示,P-DOA NPs经静脉注射后在肿瘤部位明显蓄积,并于12h达到峰值,肝脏和肾脏为其主要代谢器官;P-DOA NPs在超声作用下对小鼠皮肤黑色素瘤模型和皮肤鳞状细胞癌模型具有良好的抑瘤效果;P-DOA NPs是通过提升肿瘤组织中ROS水平、诱发肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用的;静脉注射P-DOA NPs后12h可消耗肿瘤组织内约50%的GSH;抑瘤实验过程中,药物体内安全性良好,小鼠体重无明显下降、主要器官无明显病理改变、血清生化分析结果无明显异常;P-DOA NPs在超声作用下能够诱导肿瘤细胞免疫原性死亡（ICD）,刺激肿瘤部位DC成熟细胞产生,显著增加CD8+细胞数量,降低M2巨噬细胞和MDSC细胞百分比。研究结论:本实验成功合成双前药小分子DOA并成功制备纳米前药P-DOA NPs。该二合一纳米前药P-DOA NPs能在细胞内GSH作用下降解并释放ALA和SO2。释放的ALA可以在肿瘤部位产生高浓度Pp IX,既可以通过光声成像指导治疗,还可以作为声敏剂进行声动力治疗;产生的SO2可以通过消耗GSH削弱还原性肿瘤微环境,提高ROS水平,增强SDT效果。P-DOA NPs在超声照射下对小鼠皮肤黑素瘤模型和小鼠皮肤鳞状细胞癌模型具有良好的抑瘤作用。免疫相关实验证明了P-DOA NPs在超声作用下能够促进DC细胞的成熟,将肿瘤抗原呈递给T细胞,改善肿瘤内免疫抑制微环境,从而达到SDT与免疫联合抗肿瘤的作用。总之,P-DOA NPs作为ALA和SO2的共同前药为肿瘤的临床SDT研究提供了新的思路。