研究背景子宫颈癌在世界范围内是女性高发恶性肿瘤,在癌症死亡的疾病构成比中占据重要位置。在过去40年中,子宫颈癌的发病率及病死率却发生了显著下降,这一下降趋势在发达国家尤其明显。究其原因,主要是因为女性采用定期巴氏涂片筛查,从而检出了很多癌前病变,早发现、早诊断、早治疗带来的结果。高危HPV(如HPV-16和HPV-18亚型)的慢性、持续性感染是子宫颈癌变发生的主要原因。尽管高危HPV分泌的的癌基因E6、E7在宫颈细胞恶性转化过程中起到了关键作用,然而更多的研究表明,仅有HPV感染不足以导致细胞恶变。在癌症的发生发展机制中,多种癌基因或者抑癌基因的异常表达几乎同样重要。子宫颈的癌前病变在组织病理学上被定义为上皮内瘤变(CIN, cervical intra-epithelial neoplasia),依次分级为CINⅠ、CIN Ⅱ、CINⅢ。后两者通常又归类为高级别上皮内瘤变。临床上如果不给于恰当治疗则倾向于发展为癌。然而,正常子宫颈鳞状上皮细胞是如何演变为上皮内瘤变并继而发展为浸润性癌的?确切的分子生物学机制尚未完全阐明。已经有研究发现在肿瘤生长过程中存在转录因子和凋亡相关基因表达的突变、抑制或缺失等机制。近期的研究结果报道,病毒和其他细胞因子能够结合GRIM-19,进而阻止了细胞死亡程序的启动。GRIM-19与细胞的凋亡、生长抑制、迁移、侵袭性及上皮-间质转化(EMT)等密切相关。在前列腺癌、原发性肾癌、口腔鳞癌、头颈肿瘤,肝癌和结直肠癌等常见恶性肿瘤中已经发现存在GRIM-19表达的缺失。在大多数癌症中,GRIM-19的mRNA几乎不存在突变。我们已经在前期研究工作中报道了GRIM-19通过以下三条途径抑制宫颈癌的生长：①下调STAT3诱导的基因表达;②拮抗E6/E6AP复合物形成诱导p53聚集；③诱导宫颈癌细胞的E6AP的自动泛素化。本研究中,我们旨在探讨宫颈组织和脱落细胞中GRIM-19的表达情况,试图阐明GRIM-19在肿瘤发生过程中是否存在下降?同时分析宫颈癌细胞在接受电离辐射后,GRIM-19和其调节蛋白p53的变化。本研究分为两部分：第一部分：沉默GRIM-19表达在体内、外实验中是否促进子宫颈癌的生长；电离辐射如何改变了癌细胞中GRIM-19和P53的表达。第二部分：GRIM-19表达减少与子宫颈病变脱落细胞、上皮内瘤变及癌变的相关性,及其与高危HPV感染的相关性。第一部分：GRIM-19在子宫颈癌细胞中的表达及其与电离辐射的关系目的：1.探讨GRIM-19在子宫颈癌组织中的表达水平；2.体内、外实验探讨沉默GRIM-19的表达对肿瘤细胞生长的影响及机制；3.探讨子宫颈癌细胞电离辐射后的GRIM-19表达水平变化。方法：采用Hela、SiHa(人子宫颈癌细胞株)、HaCaT(人类正常角化细胞株)以及临床组织标本分析GRIM-19的表达情况。临床标本来自安徽省立医院2010年2月～2013年7月期间30例子宫颈癌患者活检组织标本,所有患者均无远处转移；根据FIGO2014分期,ⅠB期标本10例,ⅡA期5例,ⅡB期5例,Ⅲ期10例,其中鳞状细胞癌20例,腺癌10例。另外20例子宫体肌瘤或宫颈管肌瘤患者在接受子宫肌瘤手术中,获得了正常子宫颈组织标本用于对照试验。另外选取HeLa, SiHa细胞株在电离辐射300cGy前后,进展期子宫颈癌在放射治疗(常规外照射40Gy)前后共20份子宫颈脱落细胞涂片用于研究。所有的Pap检验搜集于PreservCyte溶液,hinPrep法(Hologic, Marlborough, MA)。所有临床病例均经过活检病理明确诊断,液基细胞学涂片由至少两位有资质的细胞病理学家阅片并诊断。HeLa细胞(用GRIM-19 siRNA或对照组siRNA稳定转染)移植到6周龄的去胸腺雌性裸鼠背部皮肤下(每组有8只)用来观察肿瘤生长情况。以上标本进行如下研究：①免疫组化方法和western blot分析GRIM-19在子宫颈癌细胞株及临床组织中的表达水平；②细胞增殖实验及裸鼠成瘤实验探讨沉默GRIM-19后,肿瘤细胞的生长情况及机制；③宫颈癌细胞株电离辐射前后、以及人体子宫颈癌细胞放射治疗前后的脱落细胞中GRIM-19表达水平变化。结果：1. GRIM-19在正常子宫颈组织中的表达：近年研究中认为GRIM-19是一类的肿瘤抑制因子,我们首先在子宫颈癌细胞中检测了GRIM-19的表达情况。30份石蜡包埋的子宫颈癌标本和20份正常宫颈组织标本采用GRIM-19特异性的单抗隆抗体标记,进行免疫组织化学分析显示：GRIM-19在正常宫颈鳞状上皮和腺上皮中高表达,但是在鳞状细胞癌和腺癌中表达显著减少(如图1 A)。免疫组化定量结果示GRIM-19蛋白表达水平在宫颈鳞癌及腺癌组织中明显降低(P<0.05)(图1B)。Western blotting结果显示宫颈癌组织中GRIM-19表达蛋白水平显著下调(如图1 C)。2. GRIM-19表达减少促进Hela细胞株增殖：为了检测GRIM-19与细胞生长的生物学相关性,我们首先检测了GRIM-19在子宫颈细胞株中的表达水平。与人类正常角化细胞系HaCaT相比较,宫颈癌细胞系Hela和SiHa中GRM-19表达明显降低。采用siRNA抑制GRIM-19表达之后,与对照组相比较,在MTT实验中HeLa/G19 siRNA组细胞的增殖速度在第4天和第5天明显加快(p<0.05)(图2)。3. GRIM-19沉默后体内成瘤情况体内实验显示GRIM-19表达减少促进了肿瘤生长：为了评估GRIM-19在动物实验肿瘤生长中的作用,分别使用1×107HeLa/pCon和HeLa/G19 siRNA细胞种植到到裸鼠背部皮下组织(每组8只),监测肿瘤生长情况,并于42天处死(图3)。结果显示：第42天HeLa/G19 siRNA组肿瘤体积均值为9.8175±0.7198mm3;而对照组为7.12678±0.5689 mm3,两组差异显著(p<0.05)。剥除肿瘤通过RT-PCR和western blotting实验方法进一步验证了GRIM-19的抑制情况,同时我们发现,HeLa/G19 siRNA组中p53的表达降低,而STAT3表达水平显著升高。为了进一步探讨GRIM-19与肿瘤生长之间的关系,我们采用免疫组织化学方法检测增殖相关抗原Ki-67的表达情况。实验结果显示：与对照组相比较,在沉默GRIM-19基因的实验组肿瘤组织中Ki-67的表达显著升高(图3 E-F)。4.宫颈癌细胞电离辐射后GRIM-19表达显著升高我们还检测了HeLa和SiHa细胞株在电离辐射后GRIM-19的表达情况。将HeLa与SiHa细胞株在1.5分钟内接受300cGy高能X射线(6MV-X),24小时后检测p53和GRIM-19水平发现表达上调。人进展期子宫颈外照射40Gy(常规分割)前后选取脱落细胞,取材前使用0.05%高锰酸钾溶液充分冲洗阴道,然后检测p53和GRIM-19的表达情况。结果显示：进展期鳞状细胞癌放射治疗后子宫颈表面脱落细胞的p53和GRIM-19表达明显升高(如图4)。结论：GRIM-19基因在正常宫颈上皮细胞中高表达,在宫颈癌细胞中低表达；GRIM-19在宫颈癌细胞中表达降低通过下调p53蛋白和STAT3表达升高而促进肿瘤细胞生长和增殖；电离辐射杀伤癌细胞机制之一可能是通过上调GRIM-19表达致p53蛋白积聚而起到抗肿瘤的作用。第二部分：GRIM-19在子宫颈癌前病变及癌细胞中的表达水平及其与高危HPV感染的相关性目的：1.研究GRIM-19在人子宫颈脱落细胞中的表达特点及水平；2.研究GRIM-19的表达与高危型HPV感染的相关性；3.研究GRIM-19在癌前病变组织中的表达水平。方法：选取安徽医科大学附属省立医院妇科细胞学实验室的液基细胞学标本,包括正常鳞状上皮细胞涂片40张,ASCUS(不典型鳞状上皮细胞)涂片40张,LSIL(低度鳞状上皮内瘤变)涂片40张,HSIL(高度鳞状上皮内瘤变)涂片40张以及确诊SCC(子宫颈鳞癌)患者的脱落癌细胞标本20张。排除标准为：年龄<21岁,既往接受过子宫切除手术,无足够残留液体提取细胞蛋白质。所有的Pap检验均使用PreservCyte溶液采集、并用[hinPrep法(Hologic,Marlborough,MA,USA)处理。阴道镜下直取活检标本包括：20例正常宫颈组织、35例CIN Ⅰ、30例CIN Ⅱ、30例CIN Ⅲ和20例鳞状细胞癌标本,经10%福尔马林缓冲液固定后苏木精伊红常规方法染色。所有的巴氏涂片与组织学活检切片经由至少一位有经验的妇科肿瘤病理学家兼细胞病理学家复阅。子宫颈脱落细胞的液基细胞学诊断报告采用Bethesda系统,活检标本的组织病理学报告使用CIN(上皮内瘤变)方法。进行以下研究：①通过免疫组化分析子宫颈脱落细胞中GRIM-19表达的特点及水平；②通过Western Blotting分析子宫颈脱落细胞及宫颈癌细胞株中GRM-19表达的水平；③通过HC-2方法检测HPV感染情况,并分析子宫颈癌前病变中GRIM-19与高危HPV感染的关系；④通过.免疫组化进一步验证GRIM-19在不同级别的子宫颈上皮内瘤变和鳞状细胞癌中表达的水平及相关性。统计学分析采用SPSS软件。结果：1.子宫颈脱落细胞中GRIM-19表达的免疫组化分析子宫颈鳞状上皮结构总体上分为三层：表皮层(角化细胞),中间层,基底层。临床上细胞涂片检验采集到的子宫颈脱落细胞主要来自表皮层和中间层。我们首先分析了GRIM-19在脱落细胞中的表达,GRIM-19在子宫颈鳞状上皮的中层细胞中表达率为94.2±2.8%(188.4±5.5/200)(如图1a和a’)；而在表层细胞中的表达率是0±0%(0±0.00/200)(如图1 b和b’)。因此GRIM-19主要表达在中层细胞中,而在表层细胞(角化细胞)中不表达。我们在相应的巴氏涂片中分别记数了ASCUS细胞、LSIL细胞、HSIL细胞和SCC细胞各200个,以检测GRIM-19的表达情况。GRIM-19在ASCUS、LSIL、HSIL、SCC细胞中表达依次减低(如图2),其阴性表达率分别为：ASCUS 16.5%, LSIL 32.0%, HSIL 60.5%, SCC 97.5%(表1)。这一结果提示在子宫颈癌恶性转化的过程中GRIM-19的表达逐渐下调。GRIM-19的表达与细胞学诊断结果高度相关(p<0.001)。2.子宫颈脱落细胞GRIM-19表达的Western Blotting分析我们采用western blotting进一步研究了GRIM-19的表达水平。因为在子宫颈表皮层脱落细胞中GRIM-19不表达,所以我们在每一张涂片上计算出细胞表达百分比。在得出GRIM-19/GAPDH表达的蛋白含量数值之后,子宫颈中层细胞的GRM-19表达的相对含量采用公式：中层脱落细胞／(中层脱落细胞+表层脱落细胞)×100%。在正常宫颈中层脱落细胞中的GRIM-19/GAPDH实验组的比值被标准化定义为l。实验发现,与正常子宫颈鳞状上皮的中层细胞相比较,GRM-19表达在LSIL (P<0.05)、HSIL(P<0.05)、SCCs (P<0.001)细胞中表达显著降低(如图3A-C)。3.子宫颈癌前病变中GRIM-19表达与高危HPV感染的关系由于子宫颈鳞状细胞癌与高危HPV持续感染密切相关,我们进一步探讨了子宫颈脱落细胞中高危HPV感染和GRIM-19表达之间的关系。结果显示GRM-19的表达与高危HPV感染负相关(X2=57.583,r=-0.268,P<0.001)(见表2)。4.GRIM-19在不同级别的子宫颈上皮内瘤变和鳞状细胞癌中表达的免疫组化分析为了进一步验证GRIM-19在宫颈脱落细胞中的结果,我们通过阴道镜直取活检组织标本,在不同级别的上皮内瘤变与浸润性鳞癌组织中再次分析了GRIM-19的表达情况(如图4A-E)。结果发现,GRIM-19在正常子宫颈上皮的中层、基底层细胞的胞浆中表达几乎为100%(20/20)。免疫组织化学分析的研究结果显示GRIM-19阴性表达率为：CIN Ⅰ 20.0%(7/35), CIN Ⅱ23.3%(7/30), CINⅢ56.7% (17/30), SCC 95.0%(19/20).免疫组化染色评分结果显示,与正常宫颈组织相比,GRIM-19的表达水平在CINⅠ、CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中依次下降,且CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中的表达显著下降统计学上有差异,分别为P<0.05、P<0.05、P<0.001(如图4F)。GRIM-19的表达与病理组织学诊断结果高度相关(p<0.001)(表3)。结论：1. GRIM-19主要表达在正常宫颈上皮的中层细胞,而在表层细胞(角化细胞)中不表达。2. GRIM-19的表达与细胞学诊断结果高度相关：其表达水平在LSIL、HSIL、SCC细胞中依次降低。3. GRIM-19的表达与病理组织学诊断结果高度相关：其表达水平在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中依次逐渐下降,且CIN Ⅱ、CINⅢ、SCC中的表达显著下降。4. GRIM-19的表达与高危HPV感染负相关,GRIM-19表达的下调可能是HR-HPV感染致上皮细胞的恶性转化的关键因素之一。