论文部分内容阅读
【研究目的】 骨性关节炎(osteoarthritis,OA)又称退行性关节炎,是一种慢性、渐进性、退行性关节病变,是中老年人的常见疾病。其发生率随年龄的增长而升高,据统计我国40岁人群的患病率为10%-17%,65岁以上的老年人为60%,75岁以上人群为80%,全国大约有6500万人患有此病,致残率可高达53%。另外,随着人类平均寿命的延长以及世界范围内人口老龄化,与之相关的医疗问题及医疗费用也随之增加,同时因功能或劳动力丧失所带来的社会生产力损失以及额外经济负担也急剧增加。因此OA是导致50岁以上人群功能残疾,造成经济损失和影响社会发展的主要疾病。 骨性关节炎的发病机制现在还没有完全明确,且骨性关节炎的治疗也是一个棘手问题。临床治疗方法很多,但迄今还没有一种治疗方法能有效阻断OA的病理进展过程,而关节置换存在费用大、风险性高、假体容易出现问题等,目前在骨关节炎的基因治疗方面,国际上还处于动物实验阶段,但是软骨细胞凋亡在OA软骨退变发生发展中的如何作用,以及细胞凋亡与药物治疗OA疗效之间的关系如何,是一个值得深入研究的课题。因此本项目通过建立骨关节炎动物模型来对SIRT1在骨关节炎中的保护作用进行研究,进一步阐明OA发生发展中SIRT1的作用,为防治OA提供新的靶位;并进一步研究新型药物白藜芦醇这一SIRT1激活剂对软骨细胞凋亡和软骨下骨结构改变的影响,为药物防治OA开辟一条新的途径。 【实验方法】 一、骨关节炎动物模型的建立和分组 ○1.将32只成年雄性新西兰兔作为实验兔,施行麻醉成功后动物仰卧固定与手术台 上,右膝关节屈曲90度,消毒铺巾,行右侧关节髌骨内侧切口,向侧方牵开髌韧带,显露前交叉韧带,直视下切断并向内进行内侧半月板摘除从而建立骨关节炎动物模型。手术过程严格按照无菌要求.术后正常喂养。 ○2.分组:实验空白对照组,实验兔左侧膝关节,切开关节腔但不做处理,直接缝合形成假手术组,采用0.8ml生理盐水进行关节腔内注射,隔天注射一次。 白藜芦醇实验组,部分实验兔右侧膝关节,分别采用浓度为5.10.15μmol/L的白藜芦醇试剂0.8ml进行关节腔内注射,隔天注射一次。 透明质酸钠实验组,部分实验兔右侧膝关节,采用0.8ml透明质酸钠进行关节腔内注射,隔天注射一次。 备注:以上注射方式分别在造模后,第6到第7周进行注射,于8周后分批进行标本取材。 ○3.标本取材:将实验兔于造模8周后进行处死,取其双侧膝关节股骨髁及上下关节软骨。 二、检测方法 1.一般情况及大体标本观察 观察实验兔术后的饮食、活动及伤口愈合情况。标本采集后观察关节软骨表面。 2.骨关节炎模型兔膝关节X线观察 将实验兔麻醉后固定于X光机下,拍摄兔膝关节正侧位片.观察各实验组兔膝关节内外侧间隙,股骨髁及胫骨平台关节面。 3.HE染色 所取标本按照正规方法进行4%多聚甲醛(pH7.4)固定,脱钙,石蜡包埋后切片进行HE染色。 4.Mankins评分 根据所观察HE染色结果,依据改良Mankins关节软骨病理评分标准对切片进行评分。 5.MicroCT扫描检测 将各组标本在MicroCT下进行扫描,量化软骨下骨和骨小梁的厚度、骨密度和三维结构变的改变。 6. western-blot技术检测各组细胞Sirt1、p53的表达 提取标本软骨细胞经培养后进行western-blot技术检测各组细胞Sirt1、p53、的表达。 【实验结果】 1、一般情况及大体标本观察 (1)空白对照组:膝关节软骨表面光滑,色泽明亮,无裂纹及软化;其他各实验组:出现不同程度的骨关节炎炎性表面变化。 (2)各实验组标本表面变化均与空白对照组有显著差异,其中低剂量白藜芦醇实验组与透明质酸钠实验组差异不大,中,高剂量白藜芦醇实验组差异不大。且中,高剂量白藜芦醇实验组与低剂量白藜芦醇实验组与透明质酸钠实验组有一定差异。 2、骨关节炎模型兔膝关节X线观察 空白对照组:膝关节内外侧间隙均匀一致,股骨髁,胫骨平台关节面平整,轮廓清晰。 透明质酸钠实验组:膝关节内侧间隙变窄,胫骨平台关节面不光整。 低剂量白藜芦醇实验组:膝关节内侧间隙梢变窄,外侧间隙稍增大,股骨髁,胫骨平台关节面与透明质酸钠实验组相比尚平整。 中,高剂量白藜芦醇实验组:膝关节内侧间隙稍变窄,外侧间隙稍增大稍宽,股骨髁,胫骨平台关节面与透明质酸钠实验组相比尚平整。 3、Mankins评分 空白对照组评分为0±0,其他各实验组评分均明显高于空白对照组(P<0.05);而透明质酸钠实验组和低剂量白藜芦醇实验组评分分别为3.2±0.5和3.0±0.5,无明显差异(P>0.05);中,高剂量白藜芦醇实验组评分分别为2.35±0.5和2.16±0.5,与透明质酸钠实验组和低剂量白藜芦醇实验组存在一定差异,有统计学意义(P<0.05)。 4、MicroCT扫描检测 中,高剂量白藜芦醇实验组与低剂量白藜芦醇实验组和透明质酸钠实验组骨量体积百分比相比存在差异,有统计学意义(P<0.05);低剂量白藜芦醇实验组和透明质酸钠实验组骨量体积百分比相比无差异,无统计学意义(P>0.05)。 中,高剂量白藜芦醇实验组与低剂量白藜芦醇实验组和透明质酸钠实验组骨小 梁数目相比存在差异,有统计学意义(P<0.05);低剂量白藜芦醇实验组和透明质酸钠实验组骨小梁数目相比无差异,无统计学意义(P>0.05)。 各实验组骨小梁厚度相互比较均无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。 5、western-blot技术检测各组细胞Sirt1、p53的表达 各实验组检测Sirt1、p53的表达均显著高于空白对照组,有统计学意义(P<0.05);中,高剂量白藜芦醇实验组与低剂量白藜芦醇实验组和透明质酸钠实验组检测Sirt1、p53的表达相比存在差异,有统计学意义(P<0.05);低剂量白藜芦醇实验组和透明质酸钠实验组检测Sirt1、p53的表达相比无差异,无统计学意义(P>0.05)。 【结论】 1.白藜芦醇能激活SIRT1基因使其在OA中对软骨细胞发挥保护作用,抑制软骨细胞凋亡,能明显延缓软骨退变进程,并使其他一些损害软骨细胞的因子难以发挥协同作用,从而明显减轻骨关节炎的严重程度。 2. SIRT1基因在OA中也起着调控软骨下骨骨小梁数目和密度的作用。抑制软骨下骨骨小梁数目增加,密度增高,从而减缓骨质象牙化、骨囊肿形成及骨赘形成。