【摘 要】
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目的:肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中居首。化疗是治疗肺癌的常用手段之一,疗效较为突出但毒副作用同样明显。近几年研究发现,中医药治疗肺癌效果明显。中药蟾酥在临床上具有解毒、止痛,开窍醒神的功效。蟾毒灵是蟾酥的提取物,有较强的抗肿瘤作用。前期实验发现,蟾毒灵可以有效抑制肺癌增殖。本研究主要探讨蟾毒灵对肺癌的抑制作用及其分子机制。方法:采用CCK-8实验检测蟾毒灵对人肺癌细胞的半数抑制浓度（IC50）
【基金项目】
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国家自然科学基金（Grant 81774291）；
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目的:肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中居首。化疗是治疗肺癌的常用手段之一,疗效较为突出但毒副作用同样明显。近几年研究发现,中医药治疗肺癌效果明显。中药蟾酥在临床上具有解毒、止痛,开窍醒神的功效。蟾毒灵是蟾酥的提取物,有较强的抗肿瘤作用。前期实验发现,蟾毒灵可以有效抑制肺癌增殖。本研究主要探讨蟾毒灵对肺癌的抑制作用及其分子机制。方法:采用CCK-8实验检测蟾毒灵对人肺癌细胞的半数抑制浓度（IC50）;采用CCK-8实验检测蟾毒灵对人肺癌细胞活力的影响;采用克隆形成、软琼脂集落形成和裸鼠皮下成瘤实验检测蟾毒灵对人肺癌细胞在体内/外增殖能力的影响。通过查阅文献,筛选肺癌中高表达的差异基因;采用WB筛选出蟾毒灵干预人肺癌细胞后被抑制的原癌蛋白;采用WB检测蟾毒灵对Yes相关蛋白（yesassociated protein,YAP）下游靶基因表达的影响;采用实时荧光定量PCR检测蟾毒灵对YAP及下游靶基因的mRNA表达水平的影响;采用WB检测蟾毒灵对YAP及p-YAP蛋白表达的影响;采用IF共定位检测蟾毒灵对YAP定位的影响;分别提取胞核/胞浆蛋白,采用WB检测蟾毒灵对YAP及p-YAP在细胞中的定位及表达的影响;采用Co-IP及WB探究蟾毒灵对YAP蛋白水平降解的影响。采用WB探究蟾毒灵提高YAP相对磷酸化水平的原因;采用实时荧光定量PCR检测YAP上游蛋白对YAP mRNA表达水平的影响;采用Co-IP实验探究蟾毒灵对LATS与YAP结合水平的影响。结果:CCK-8实验结果显示蟾毒灵的IC50为40ng/ml。CCK-8、克隆形成、软琼脂集落形成及裸鼠皮下成瘤实验结果均显示蟾毒灵对人肺癌细胞在体内/外的增殖能力有抑制作用。查阅文献筛选肺癌中高表达的差异基因,并通过WB验证,结果显示蟾毒灵可抑制YAP蛋白表达;WB实验结果显示蟾毒灵降低YAP下游靶基因Cyr61及CTGF的表达;实时荧光定量PCR实验结果显示蟾毒灵对YAP mRNA表达水平无影响;实时荧光定量PCR实验结果显示蟾毒灵降低YAP下游靶基因的mRNA表达水平;WB实验结果显示蟾毒灵抑制YAP及p-YAP蛋白的表达,但提高pYAP/YAP比值即磷酸化水平;IF共定位及WB实验结果显示蟾毒灵抑制YAP的核定位。Co-IP及WB实验结果显示蟾毒灵促进YAP与β-Tr CP的结合水平。WB实验结果显示蟾毒灵通过经典通路中MST-LATS调控YAP磷酸化水平;实时荧光定量PCR实验结果显示YAP上游蛋白MST及LATS对YAP mRNA表达水平无影响;Co-IP及WB实验结果显示蟾毒灵提高LATS与YAP结合水平。结论:蟾毒灵抑制肺癌细胞的体内/外增殖。蟾毒灵可以促进LATS与YAP的结合以提高YAP磷酸化水平,使YAP滞留在胞质中与β-Tr CP结合后被降解,并无法顺利进入核内激活下游靶基因Cyr61和CTGF的表达,从而抑制肺癌细胞增殖。
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