实验一建立大脑中动脉阻塞（MCAO）大鼠模型,探究益神方对血管性认知障碍模大鼠认知行为的影响目的:以Wistar大鼠为实验对象,利用大脑中动脉阻塞（MCAO）法建立血管性认知障碍动物模型,并依据行为学测试等方法观察药物干预前后不同组别大鼠认知行为及功能的变化,探讨中药复方益神方对改善认知障碍大鼠认知行为及功能的影响。方法:1、组别设置:实验动物为雄性Wistar大鼠,在正式实验开始之前,需要通过认知行为学测试筛除部分先天不足及对实验结果有影响的器质性缺陷大鼠,剩余共65只,依据随机数字表法设置假手术组、模型组、中药益神方组,西药盐酸多奈哌齐（安理申）组。2、建立模型:采用大脑中动脉阻塞（MCAO）法建立血管性认知障碍大鼠模型。3、药物干预:中药治疗组予以复方益神方进行干预,西药组予以盐酸多奈哌齐（安理申）进行干预,假手术组和模型组则分别予以同等体积的蒸馏水进行干预,干预方法为灌胃,治疗周期均为6周。4、认知行为学检测:各组大鼠分别于造模后及药物干预结束后再进行Morris水迷宫行为学检测,为期5天,包括定位航行实验和空间搜索实验两部分内容。结果:造模结束后,依据造模成功的大鼠行为学测试结果绘制记忆曲线,经过统计分析可知,在第一部分的定位航行测试中,假手术组大鼠的逃避潜伏期较短,且寻找到目标平台的效率高,说明经过一定时间的学习训练后,正常健康大鼠经过反复学习训练,能够获得并存储安全平台的路线及位置信息;手术组大鼠因手术造成血管栓塞,影响大脑认知功能,因此寻找到平台花费的时间更长,差异有统计学意义（P＜0.05）;药物干预前的益神方组,安理申组及模型组三组潜伏期进行组间两两相比,无统计学差异（P＞0.05）。由第5天的空间搜索实验结果可见,假手术组大鼠在有效区域运动距离及进入次数,目的象限停留的时间及百分比,运动距离及进入次数均优于其他三组,且有统计学差异（P＜0.05）,模型组与益神方组,安理申组两两比较,差异无意义（P＞0.05）。药物干预6周后,Morris水迷宫实验结果显示:安理申组,益神方组大鼠学习记忆能力改善,寻找到安全平台用时少,潜伏期短。模型组大鼠寻找到平台的时长总体仍高于其他三组,且结果有统计学差异（P＜0.05）。益神方组及安理申组大鼠寻找平台的效率均有所提高,且疗效相当,差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠在空间搜索实验中的表现与其他三组相比,在目的平台停留的时间及进入次数,有效区域运动时间、运动距离、有效区域进入次数及第四象限运动距离这几个方面,能力较弱,差异结果有统计意义（P＜0.05）,假手术组、安理申组、益神方组组间两两比较,无统计学差异（P＞0.05）。结论:通过大脑中动脉阻塞（MCAO）法建立的大鼠脑缺血模型,可以很好的模拟血管性因素造成的认知功能障碍,为临床治疗血管性认知功能障碍提供了较为科学直观的参考。大脑血管阻塞导致脑部供血不足,对应的脑组织出现损伤,海马神经功能出现障碍,影响学习和记忆。通过行为学测试结果发现,模型组大鼠利用空间线索定位水下平台的能力下降。予以手术组大鼠中药复方益神方及西药安理申进行干预,大鼠的学习能力均得到了改善,与模型组比较差异具有统计学意义。益神方组与安理申组组间两两比较,差异不明显。实验表明益神方可修复大脑组织损伤,改善认知障碍大鼠的空间学习能力,并且可增强学习所获得的信息提取能力,从而记住测试平台的路线和位置。实验二 疏肝益神法指导下的中药治疗对血管性认知障碍大鼠大脑海马组织神经元细胞和BDNF及其相关通路蛋白的影响。目的:通过相关检测手段观察脑缺血模型大鼠海马神经元细胞形态变化,检测BDNF及其相关通路蛋白的表达水平,探讨益神方对血管性认知障碍模型大鼠认知功能改善的作用机制。方法:最后一次认知行为学检测结束后进行取材,大鼠断头取脑后,剥离出全脑组织及海马备用。透射电子显微镜观察海马神经元细胞形态;免疫组化法检测大鼠海马CAI区proBDNF、p75NTR阳性细胞平均光密度值;Western Blot法检测大鼠海马组织BDNF、proBDNF、p75NTR蛋白水平及TrkB、Akt蛋白磷酸化水平及与总蛋白的百分比。结果:（1）透射电子显微镜结果显示:高倍镜下,选取海马CAI区域神经元细胞进行观察,比较各组神经元细胞形态发现,模型组大鼠神经元细胞核较假手术组向周边移位,核膜出现凹陷,染色质颜色较假手术组深,线粒体异常,肿胀变性,溶解,体面积增大,内外膜,内外腔及嵴稀疏萎缩变窄,内质网变疏松;益神方组及安理申组大鼠海马神经元细胞经药物治疗后,海马神经元核膜恢复连续性,细胞核接近正常位置,线粒体形态得以恢复。由此可知,中药益神方对海马神经元细胞具有良性修复促进作用。（2）Western Blot结果显示:假手术组,安理申组,益神方组大鼠与模型组相比,海马组织细胞中的proBDNF水平下调,差异具有显著性（P＜0.05）,三组组间两两比较,差异不显著（P＞0.05）;药物干预治疗后,益神方组与西药安理申组p-Akt,p-TrkB蛋白表达水平有增高趋势,与模型组相比有显著差异（P＜0.05）,且三组p-Akt/t-Akt,p-TrkB/t-TrkB 比值呈现相同趋势,有统计学意义（P＜0.05）。模型组p75NTR表达水平高于其他三组,与假手术组相比差异有意义（P＜0.05）,但与中药组,西药组组间两两比较差异无统计学意义。BDNF在益神方组,安理申组大鼠海马组织中的表达较模型组增加,统计数据分析差异有显著性（P＜0.05）,与假手术组相比无显著差异。（3）免疫组化结果显示:模型组大鼠海马CA1区proBDNF、p75NTR阳性细胞信号较强,高于假手术组、安理申组、益神方组,差异具有显著性（P＜0.05）,后面三组组间两两比较,差异不明显（P＞0.05）。结论:益神方以“从肝论治”理论为指导原则进行配伍,临床治疗发现本方可以疏肝益神,滋养脑髓,疏通脑窍,对血管性认知障碍有治疗作用,为了研究本方的作用机制,观察治疗效果,设计本实验方案进行实验研究。通过大脑中动脉阻塞（MCAO）法建立血管性认知障碍大鼠模型,模拟患者的疾病状态,予以益神方进行干预,通过行为学测试观察不同组别大鼠的认知功能改善情况。在行为学测试结束后,取实验大鼠的海马组织进行指标检测,发现益神方可通过调节脑源性神经营养因子及级联通路上相关蛋白的表达,减少细胞凋亡,使海马神经元细胞得到保护,恢复神经功能,进而改善认知功能。