论文部分内容阅读
研究目的细胞自噬与起源于造血髓系定向干细胞的克隆性疾病——骨髓增生异常综合征（MDS）的发病及其向急性髓系白血病（AML）转化密切相关。自噬过程囊括了组蛋白翻译后修饰在内的表观遗传程序。本项研究通过比较正常人、MDS患者骨髓单个核细胞（BMMNCs）自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、人类第一雄性缺失乙酰化转移酶（hMOF）及H4K16乙酰化（H4K16ac）表达水平,使用有效核心组方三子黄石散干预MDS细胞株SKM-1后检测其对细胞自噬、hMOF及H4K16ac水平产生的影响,采用流式术（FCM）、蛋白质免疫印迹法（Western-bolt）、酶联免疫吸附测定（ELISA）及共聚焦显微镜（CLSM）等方法证实:1、MDS患者及正常人细胞自噬与hMOF及H4K16ac表达水平具有相关性。2、三子黄石散能够促进SKM-1细胞自噬以抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,从而发挥自噬对机体的保护作用。3、三子黄石散通过促进hMOF及H4K16ac诱导细胞自噬。研究方法本研究收集MDS患者10例及正常人5例,分别提取BMMNCs,使用Western-blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、hMOF及H4K16ac蛋白表达水平,FCM检测细胞自噬荧光强度,使用SPSS 21.0统计软件对实验结果进行统计分析。同时,本研究选取MDS细胞株SKM-1,加入不同浓度的三子黄石散干预24h、48h、72h后,使用MTT检测细胞增殖能力并计算不同时间段IC50值;将适宜浓度的三子黄石散与自噬抑制/诱导剂联用后,采用MTT检测细胞增殖抑制率,FCM检测细胞凋亡水平;加入不同浓度的三子黄石散干预24h及适宜浓度的三子黄石散干预0、3、6、12、24h 后,采用 Western-blot 检测 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、P62、hMOF、H4K16ac 蛋白表达水平,Elisa法检测H4K16ac浓度;将自噬抑制剂氯喹预处理细胞后加入适宜浓度的三子黄石散,24h后采用FCM检测细胞自噬荧光强度,CLSM观察细胞自噬囊泡;构建低表达hMOF的SKM-1稳定株,采用RT-PCR检测细胞转染效率,加入适宜浓度的三子黄石散药液干预24h后,使用Western-blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、hMOF、H4K16ac蛋白表达水平,FCM检测细胞自噬荧光强度;使用SPSS 21.0统计软件对实验结果进行统计分析。研究结果一、MDS患者及正常人细胞自噬与hMOF、H4K16ac水平特点分析1.FCM检测正常人与MDS患者BMMNCs自噬荧光强度差异,结果发现:MDS患者BMMNCs自噬荧光强度低于正常人2.Western-blot检测正常人与MDS患者BMMNCs自噬相关蛋白表达差异,结果发现:MDS患者BMMNCs LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达低于正常人3.Western-blot检测正常人与MDS患者BMMNCs表观遗传相关指标表达差异,结果发现:MDS患者BMMNCs hMOF、H4K16ac蛋白表达水平低于正常人二、三子黄石散对SKM-1细胞自噬作用研究1.以不同浓度的三子黄石散干预SKM-1细胞不同时间,采用MTT检测细胞增殖能力,结果发现:三子黄石散对SKM-1细胞增殖具有抑制作用,24h、48h及72h 处理的 IC50 值分别是 375.949ug/ml、104.447ug/ml 及 60.802ug/ml,呈时间和剂量依赖性。将三子黄石散与自噬抑制剂3-MA联用后结果发现:与空白对照组相比,3-MA组细胞增殖能力增强（P＜0.05）,3-MA+三子黄石散组细胞增殖能力降低（P＜0.01）,三子黄石散组细胞增殖能力显著降低（P＜0.001）。将三子黄石散与自噬诱导剂Repa联用后结果发现:与空白对照组相比,Repa组细胞增殖能力降低（P＜0.05）,Repa+三子黄石散组细胞增殖能力显著降低（P＜0.001）;与三子黄石散组相比,Repa+三子黄石散组细胞增殖能力降低（P＜0.05）。2.以不同浓度的三子黄石散干预SKM-1细胞不同时间,采用Western-blot检测LCⅡ/Ⅰ、P62、Beclin-1蛋白表达,结果发现:三子黄石散浓度为300μg/ml、450μg/ml、600μg/ml干预SKM-1细胞24h后,与空白对照组相比,P62表达水平均显著降低（P＜0.001）,LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平均升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）,Beclin1蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001）。进一步经300μg/ml三子黄石散干预SKM-1细胞0、3、6、12、24h后,与空白对照组相比,6h、12h、24h时P62表达水平均明显降低（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001）,而 LC3Ⅱ/Ⅰ 表达水平均升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）,12h、24h时Beclin1蛋白表达水平均升高（P＜0.05,P＜0.01）。3.使用自噬抑制剂CQ预处理细胞后加入300μg/ml和600μg/ml的三子黄石散干预,采用FCM检测细胞自噬荧光强度结果发现:与空白对照组相比,CQ抑制后自噬荧光强度降低无统计学差异（P＞0.05）,300μg/ml和600μg/ml三子黄石散组自噬荧光强度升高（P＜0.01,P＜0.001）,300μg/ml三子黄石散+CQ组自噬荧光强度无统计学差异（P＞0.05）,600μg/ml三子黄石散+CQ组自噬荧光强度出现升高（P＜0.01）。与CQ组相比,600μg/ml三子黄石散+CQ组自噬荧光强度升高（P＜0.01）。采用CLSM检测细胞自噬囊泡,结果发现:与空白对照组相比,600μg/ml三子黄石散组自噬囊泡定量水平升高（P＜0.01）,600μg/ml三子黄石散+CQ组自噬囊泡定量水平有所升高（P＜0.05）。与CQ组相比,600μg/ml三子黄石散+CQ组自噬囊泡定量水平有所升高（P＜0.01）。4.将三子黄石散与自噬抑制剂3-MA或自噬诱导剂Repa联用干预SKM-1细胞后,采用FCM检测细胞凋亡水平,Western-blot检测促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白BCL-2表达。与自噬抑制剂3-MA联用后结果发现:与空白对照组相比,3-MA组细胞凋亡水平降低无统计学差异（P＞0.05）,Bax表达水平显著降低（P＜0.001）,BCL-2表达水平升高（P＜0.01）;三子黄石散组细胞凋亡水平显著升高（P＜0.001）,Bax表达水平升高（P＜0.01）,BCL-2表达水平降低（P＜0.01）;3-MA+三子黄石散组细胞凋亡水平无统计学差异（P＞0.05）,Bax、Bcl-2表达水平无统计学差异（P＞0.05）。与自噬诱导剂Repa联用后结果发现:与空白对照组相比,Repa组细胞凋亡水平升高（P＜0.05）,Bax表达水平升高（P＜0.01）,BCL-2表达水平降低（P＜0.01）,Repa+三子黄石散组细胞凋亡水平显著升高（P＜0.001）,Bax表达水平显著升高（P＜0.001）,Bcl-2表达水平显著降低（P＜0.001）。与三子黄石散组相比,3-MA+三子黄石散组细胞凋亡及Bax表达水平降低（P＜0.01,P＜0.01）,Bcl-2表达水平降低（P＜0.01）。与Repa组相比,Repa+三子黄石散组细胞凋亡水平升高（P＜0.01）,Bax表达水平无统计学差异（P＞0.05）,Bcl-2表达水平降低（P＜0.05）。三、三子黄石散对SKM-1细胞自噬的表观遗传调控机制研究1.以不同浓度的三子黄石散干预SKM-1细胞不同时间,采用Western-blot检测hMOF及H4K16ac蛋白表达,Elisa检测H4K16ac浓度变化,结果发现:三子黄石散浓度为 15 0μg/ml,300μg/ml,450μg/ml,600μg/ml 干预 SKM-1 细胞 24h后,与空白对照组相比,hMOF蛋白表达水平升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.001）。浓度为 300μg/ml,450μg/ml,600μg/ml 时,H4K16ac 表达水平升高（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）,H4K16ac 表达浓度升高（P＜0.001）。进一步经300μg/ml三子黄石散干预SKM-1细胞0、3、6、12、24h后,结果发现,在12h、24h时,hMOF及H4K16ac表达增加（P＜0.05,P＜0.01）,H4K16ac表达浓度显著升高（P＜0.001）。2.构建敲低hMOF的SKM-1细胞模型,RT-PCR检测细胞转染效率,三子黄石散干预后Western-blot检测各组细胞hMOF、H4K16ac及LCⅡ/Ⅰ蛋白表达,FCM检测各组细胞自噬荧光强度。结果发现:与空白对照组相比,敲低组hMOF、H4K16ac及LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平均降低（P＜0.01）,三子黄石散组hMOF、H4K16ac及LC3Ⅱ/Ⅰ表达均升高（P＜0.01）。与hMOF敲低组相比,敲低+三子黄石散组hMOF、H4K16ac表达水平升高（P＜0.05）,LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平升高,但无统计学差异（P＞0.05）。流式对自噬强度的结果显示,与空白对照组相比,敲低组自噬荧光强度降低（P＞0.05）,三子黄石散组、Repa组自噬荧光强度升高（P＜0.05）,敲低+三子黄石散组及敲低+Repa组自噬荧光强度降低,但无统计学差异（P＞0.05）。与敲低组对比,敲低+三子黄石散组自噬荧光强度升高（P＜0.05）,敲低+Repa组自噬荧光强度升高（P＜0.01）。结论1.MDS患者BMMNCs自噬荧光强度、细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ及hMOF、H4K16ac蛋白表达低于正常人,表明hMOF、H4K16ac表达水平与细胞自噬呈正相关。2.细胞自噬在MDS中起到保护作用:三子黄石散能够通过增强SKM-1细胞自噬以抑制其细胞增殖和诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。3.敲低hMOF表达SKM-1细胞自噬水平受到抑制,而加入三子黄石散干预后自噬水平升高,提示三子黄石散能够促进hMOF上调H4K16ac表达诱导细胞自噬。