根据2020年的全球流行病学报告,有超过100万例新确诊胃癌患者,而超过一半的病例发生在中国。胃癌的致癌过程是包括胃炎、肠化生和上皮瘤变在内的病变过程。由于发病隐匿和症状轻微,大部分癌症患者发现时已经是晚期,其5年生存率仅为35%。一些生物医学研究表明,幽门螺杆菌感染和慢性炎症参与胃癌发展,但胃癌进展的具体机制尚不清楚。因此,发现新的胃癌生物标志物和胃癌治疗靶点是迫切和必要的。一些研究已经发现了 Hippo信号通路与胃癌之间的潜在联系。Hippo信号通路在器官大小控制、组织稳态、癌变和免疫反应等多个生物过程中起着重要作用。Hippo信号的激活受磷酸化级联反应控制的,在哺乳动物中Hippo激酶MST1/2磷酸化LATS1/2激酶,而磷酸化的LATS1/2促进YAP/TAZ蛋白的磷酸化,导致滞留在细胞质并被降解。如果Hippo信号通路失活,未被磷酸化的YAP/TAZ就会易位到细胞核中,并与多个转录因子相互作用,促进其靶基因的表达。在幽门螺杆菌诱导小鼠胃癌模型中,YAP/TAZ过表达抑制胃癌的进展。然而,尽管研发靶向Hippo信号的药物已经付出了大量的努力,其临床应用仍处于不成熟阶段。TAZ（与PDZ结合基序的转录共激活因子,Transcriptional Co-Activator With PDZ-Binding Motif）是Hippo信号的下游效应蛋白,是多个转录因子的转录辅助因子,包括TEAD。一些研究表明,TAZ可能是人类癌症致癌的一个关键因素。在人类癌症样本中,TAZ蛋白水平在乳腺癌和胃癌中水平升高,其表达水平与预后不良相关。作为泛素-蛋白酶体系统的组成成分,靶向TAZ蛋白可以恢复Hippo信号通路的肿瘤抑制功能,从而抑制胃癌的进展。蛋白质的稳定性调控受泛素化和去泛化素之间平衡的影响,这是维持正常生理稳态的关键。蛋白质泛素化调控的中断可能导致多种人类疾病,包括癌症。研究发现了个E3泛素连接酶对Hippo通路效应因子发挥作用,调节Hippo信号活性和癌症进展。虽然有研究报道了几种去泛素酶参与调节Hippo信号,但仍不清楚哪一种去泛素酶产生重要影响。通过去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes,DUBs）siRNA筛选文库,我们发现DUB1是调节胃癌患者Hippo通路活性的关键调节因子,而DUB1在胃癌样本中升高,且胃癌患者预后不良与TAZ表达相关。但是DUB1在胃癌中的功能尚不明确,因此进一步探究DUB1在胃癌中的功能具有重要的作用及临床意义,为寻求可能的治疗靶点提供新的方向。研究目的旨在筛选出对胃癌Hippo通路发挥调控作用的去泛素化酶;证明DUB1蛋白在胃癌中对Hippo通路的调节机制;为临床上胃癌的治疗提供新的潜在靶点和策略。研究方法1.通过对DUBs的siRNA文库进行筛选并选用Hippo通路经典靶基因CTGF作为阅读窗口,探索可调节Hippo信号通路的去泛素化酶。2.通过生物信息学及免疫组化验证DUB1和TAZ在胃癌组织中的表达及预后关系。3.RNA-seq数据分析沉默DUB1后胃癌细胞中Hippo信号通路的变化。4.通过CCK8、Transwell实验、克隆形成、EdU实验以及小鼠移植瘤实验验证DUB1对胃癌增殖、侵袭及迁移的影响。5.通过Rescure实验,在沉默DUB1胃癌细胞系中过表达TAZ,观察Hippo下游靶基因的变化及对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。6.使用荧光报告酶实验检测TEAD反应元件的活性,确定DUB1对Hippo信号通路活性的影响。7.通过免疫荧光实验、核浆分离实验、免疫共沉淀实验检验DUB1和TAZ的定位及是否具有相互作用。构建DUB1和TAZ蛋白各自不同结构域的质粒,检测两者互相结合的具体区域。8.运用Western blot实验技术,通过MG132实验、CHX实验、细胞水平及体外泛素化实验、CO-IP实验等,分析DUB1对TAZ的去泛素化修饰方式及TAZ的修饰位点。研究结果1.DUB1在人胃癌中表达升高,并与整个基因组范围内的Hippo信号活性相关:通过对DUBs的SiRNA文库筛选,我们发现DUB1对YAP/TAZ下游靶基因CTGF具有显著的调节作用。通过生物信息学分析及组织样本免疫组化提示DUB1在人胃癌中表达升高并且与预后直接相关。通过沉默DUB1行RNA-seq测序,提示DUB1与胃癌整个基因组范围内的Hippo信号活性相关。2.DUB1促进胃癌细胞中的Hippo/TAZ轴信号通路:Western blot实验及QPCR提示在胃癌细胞系中,当沉默DUB1后,胃癌细胞中YAP的表达无明显变化,TAZ可见显著下降。荧光素酶报告实验说明DUB1可直接影响TAZ下游TEAD的转录活性。3.DUB1消耗可抑制胃癌在体内和体外的进展:体外实验证实敲低DUB1可显著抑制细胞的增殖及克隆形成能力,体内细胞移植瘤实验说明敲低DUB1可显著抑制移植瘤的生长。4.DUB 1通过Hippo/TAZ轴控制胃癌的进展:通过Rescure实验,在沉默DUB 1胃癌细胞系中过表达TAZ,观察到Hippo下游靶基因升高,胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭功能恢复,证实DUB1是通过调控TAZ来影响胃癌的进展。5.DUB1与TAZ相关联,并在胃癌细胞中调节TAZ的稳定性:免疫荧光及核浆分离实验说明DUB1和TAZ共定位于细胞核,CO-IP实验说明DUB1和TAZ存在结合。CHX和MG132实验验证DUB1通过泛素-蛋白酶体途径影响TAZ的降解。6.DUB1通过抑制TAZ K48连接的多聚泛素化来稳定TAZ:通过体内及体外去泛素化实验说明DUB1直接作用于TAZ,进而移除TAZ上的泛素链。通过泛素K48位点突变行CO-IP实验说明主要通过抑制TAZ K48连接的多聚泛素化来稳定TAZ。通过TAZ的突变体来进行泛素化分析。数据显示,K39和K157位点是TAZ蛋白中最有可能发生DUB1去泛素化的位点。结论DUB1是胃癌中Hippo信号通路的重要调节因子,在临床样本分析中,DUB1表达显著升高并与胃癌的预后直接相关。在胃癌细胞模型中,DUB1通过直接抑制TAZ K48位点的多泛素和降解直接影响胃癌的进展。综上所述,本研究发现了一种新的去泛素酶DUB1通过调节Hippo/TAZ导致胃癌的进展,还发现了其具体的调控结合位点,为胃癌的治疗提供了新靶点和新思路。