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目的:本课题拟从体外、体内及临床研究等三个方面阐明miR-21-5p对AECⅡ凋亡的调控及作用机制,以期揭示防己黄芪汤预处理介导miR-21-5p对AECⅡ凋亡的干预作用机理,为中医药参与胸外科围微创手术期肺保护提供理论依据。方法:1.体外研究:大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN)原代培养,选取第三代单层细胞为研究对象,建立细胞缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,制备miR-21-5p敲低质粒及不同剂量防己黄芪汤含药鼠血清进行细胞干预,将细胞分为如下几组:对照组、simiR-21-5p组、低剂量含药鼠血清组、中剂量含药鼠血清组、高剂量含药鼠血清组,细胞继续培养48小时,RT-PCR检测各组细胞内miR-21-5p表达;CCK-8、Annexin V-FITC法检测各组细胞增殖及凋亡活性;Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Survivin、Bax及TLR4/NF-κB信号通路蛋白浓度表达;双荧光素酶基因法检测miR-21-5p与TLR4之间靶向关系。2.体内研究:选取清洁级健康新西兰雄性白兔,拟制备兔OLV下模拟胸腔镜(VATS)肺楔形切除手术模型,根据实验要求分为对照组(NS灌胃处理+手术)、防己黄芪汤处理组(中药灌胃处理+手术)、miR-21-5p抑制剂处理组(鼻腔滴入200μL含miR-21-5p抑制剂的慢病毒液+手术)三组,以上各组给予预处理连续3天直到造模前结束。分别于在OLV前(T0)、OLV后30min(T1)和恢复双肺通气(Two lung ventilation,TLV)30min(T2)三个时间点记录心率(HR)、平均动脉压(MAP)和气道峰压(Ppeak),血气分析测PH值、动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、血氧饱和度(SaO2)等;HE染色分析各组模型兔术侧肺组织病理变化;RT-PCR检测肺组织内miR-21-5p的表达;Western-blot检测肺组织内TLR4、NF-κB蛋白浓度表达;TUNEL检测肺组织AECII凋亡情况。3.临床研究:采用随机、对照、开放的临床试验设计,收集符合外周型孤立肺小结节(solitary pulmonary nodule,SPN)诊断标准的心胸外科入院患者,分为试验组和对照组。试验组术前予以防己黄芪汤口服治疗3天后(对照组无术前中药干预)行胸腔镜下肺结节楔形切除术;观察插管后即刻TLV时(T0)、OLV60min(T1)、OLV结束即刻(T2)的平均动脉压(MAP)、心率(HR)、脉搏氧饱和度(SpO2)、气道峰压(Ppeak)、血气指标分析;HE染色分析两组患者切除标本临近病灶正常肺组织病理状态,测定肺泡损伤率;RT-PCR检测切除标本肺组织内miR-21-5p的表达;TUNEL检测标本肺组织AECII凋亡指数;另于术后第1天(T3)、第3天(T4)及第5天(T5)进行两组患者术后中医症状积分比较分析,并于T3、T5两个时刻点进行急性肺损伤评分及中医疗效比较分析。结果:1.体外研究:RLE-6TN-H/R模型的建立及miR-21-5p敲低质粒后可下调miR-21-5p-mRMA的表达,防己黄芪汤含药鼠血清的干预可逆转上述现象,各剂量组与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05);H/R模型的建立及miR-21-5p敲低质粒后可下调RLE-6TN增殖活性及Bcl-2、Survivin蛋白表达,上调RLE-6TN的凋亡活性及Bax蛋白表达;防己黄芪汤含药鼠血清的干预则可上调细胞活性及Bcl-2、Survivin蛋白表达,下调细胞的凋亡活性及Bax蛋白表达,体现出剂量依赖性;各剂量组与对照组相比较,差异有显著性(P<0.05);H/R模型的建立和miR-21-5p敲低质粒后可上调RLE-6TN内TLR4、NF-κB蛋白表达,防己黄芪汤含药鼠血清的干预则可下调细胞内TLR4、NF-κB蛋白表达,亦体现出剂量依赖性;各剂量组与对照组相比较,结果存在显著差异(P<0.05);miR-21-5p的mRNA 3’非编码区预测到一个TLR4结合位点,构建突变型报告基因载体(mut-pGL3-TLR4-3’UTR)、TLR4的荧光素酶野生型(wt-pGL3-TLR4-3’UTR),将不同组合的野生型和突变型pGL3-TLR4-UTR表达载体得以转染至AECII细胞中,共转染野生型表达载体报告基因活性明显低于对照组的,差异有显著性(P<0.05)。2.体内研究:各组模型兔在T0、T1、T2时刻的MAP、SPO2、PH、PaCO2数据差异性小,无统计学意义(P>0.05);T0-T1时期各组模型兔的HR、Ppeak上升,SaO2、PaO2下降,两实验组上述参数变化与对照组相比较,存在统计学差异(P<0.05)。miR-21-5p抑制剂预处理组参数变化幅度较为明显。与防己黄芪汤预处理组相比,具显著差异(P<0.05)。T1-T2时刻各组兔HR、Ppeak下降,SaO2、PaO2上升,氧合能力得到改善,差异有统计学意义(P<0.05);OLV+VATS模型建立后,实验兔术侧肺标本组织结构紊乱,出现肺泡壁断裂破坏、炎性细胞浸润现象,;miR-21-5p抑制剂的处理可以进一步加重该种病理现象,除组织结构均紊乱,肺泡壁出现断裂破坏外,还出现肺泡腔塌陷,肺泡的毛细血管扩张等现象,术侧标本肺组织损伤明显加重;防己黄芪汤的预处理可以减缓术侧标本肺病理组织损伤:组织结构尚清晰,肺泡间隔水肿不显,有少量的炎性细胞的浸润,肺实质性损伤程度降低。各组病理组织评分相比,差异有统计学意义(P<0.05);miR-21-5p抑制剂的预处理可以下调实验兔术侧肺标本组织内miR-21-5p的表达,防己黄芪汤的预处理可以提升其组织内miR-21-5p的表达,差异有统计学意义(P<0.05);miR-21-5p抑制剂的预处理可以提升实验兔术侧肺标本组织内TLR4、NF-κB的表达,防己黄芪汤的预处理则能下调其组织内TLR4、NF-κB的表达,差异有统计学意义(P<0.05);miR-21-5p抑制剂预处理可提高实验兔术侧肺标本组织细胞的凋亡指数,防己黄芪汤预干预则可抑制细胞的凋亡指数,差异有统计学意义(P<0.05)。3.临床研究:两组患者术前临床资料及术后病理资料及各时点的MAP、HR、SPO2、数据差异性小,无统计学意义(P>0.05);血气指标随时间进展体现出一定的差异性:其中T0-T1时刻,PaO2下调,Pairway上调,T1-T2时刻,PaO2上调,Ppeak下调,T3-T5时刻PaO2体现出上升的趋势,且试验组增幅大幅度高于对照组,差异很显著(P<0.05);患者术前短期服用防己黄芪汤能够提高术侧肺标本组织内miR-21-5p的表达,差异有统计学意义(P<0.05);对照组切除肺标本临近病灶的正常组织结构紊乱,出现肺泡壁断裂破坏、肺泡腔内出现大量水肿以及炎性细胞浸润现象;防己黄芪汤预处理则可明显减缓这一急性肺损伤病理现象,术侧肺标本病理组织的评分显示差异有统计学意义(P<0.05);防己黄芪汤预处理可以抑制术侧肺标本组织细胞的凋亡指数,差异有统计学意义(P<0.05);随着术后时间的延长,两组患者中医症状积分均体现出下调的趋势,在T3、T4、T5等不同时刻的中医症状积分低于对照组,存在统计学差异(P<0.05);对照组整体有效率为80.00%;试验组有效率为93.33%,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,防己黄芪汤预处理,能够显著缩短患者的进食时间、首次下床时间、胸管保留时间和住院时间,以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.防己黄芪汤可通过调控miR-21-5p表达来干预H/R模型RLE-6TN内TLR4/NF-κB信号通路的活性,进而影响其凋亡能力。2.防己黄芪汤预处理可通过上调OLV+VATS模型兔术侧萎陷肺的miR-21-5p的表达来抑制TLR4/NF-κB信号通路的活性,进而抑制术侧肺组织AECII的凋亡能力,最终干预OLV-ALI的病情进展。3.对于行OLV+VATS下肺楔形切除术的患者,于术前口服防己黄芪汤可以影响术中患肺组织的AECII凋亡水平,可能与其通过调控miR-21-5p的表达相关,进而实现对术后早期的OLV-ALI进程的相关干预。