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研究背景:原发性肝细胞癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。尤其在我国,因为乙型肝炎巨大的感染人群,其发病率一直居高不下。由于肝癌患者早期常缺乏典型的临床症状,且肝癌恶性程度高,发展迅速,大多数患者确诊时已属晚期,虽然随着研究的不断深入,肝癌的治疗手段越来越多,但晚期患者治疗效果仍不满意。因此,明确肝癌发生发展的分子生物学机制,以便早期发现早期治疗,在肝癌的治疗中意义重大。miRNAs主要作用于靶基因mRNA的3′非翻译区,抑制靶基因的翻译,促使靶基因mRNA的分解,从而影响靶基因的表达水平。研究表明,miRNAs在恶性肿瘤的发生和浸润转移过程中,起着非常重要的作用。其中,miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p均被证明在肝癌的发生发展中发挥负向调控作用,但其作用机制不甚明朗。SPOCK1基因是钙离子结合蛋白聚糖家庭的一员,可能参与细胞与细胞外基质相互作用的过程中,与细胞的增殖、凋亡和转移有密切的关系。研究表明,SPOCK1在多种肿瘤中表达上调,在促进肿瘤细胞增殖和浸润转移,抑制肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用,但在肝癌中的研究较少。目的:明确miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p在肝癌中的表达情况,及其表达情况与肝癌细胞增殖、浸润和凋亡的关系。明确miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p是否存在共同的靶基因,研究其共同靶基因在肝癌中的表达情况,及其与肝癌细胞增殖、浸润和凋亡的关系。方法:1.收集了46例肝癌组织样本及其癌旁正常组织,培养了Hep G2、Hep3b肝癌细胞株和HL-7702正常肝细胞株,分别q RT-PCR检测miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p在肝癌细胞和癌旁正常肝细胞,以及不同细胞株中的表达情况。2.使用三种miRNA mimics分别转染肝癌细胞系Hep G2、Hep3b,使两种细胞系中三种miRNA的表达上调,分别q RT-PCR确认各组转染效果,MTT比色法比较转染miRNA前后细胞的增殖活性,Transwell小室法比较转染前后细胞的侵袭细胞数,流式细胞仪检测比较转染前后细胞的凋亡情况,以评估三种miRNAs对肿肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。3.使用生物信息学数据库预测miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p共同的靶基因,RNA pull down法选取其中可能性最大的靶基因SPOCK1进一步验证。分别使用q RT-PCR和Western Blot检测肝癌组织和癌旁正常组织中三种miRNA、SPOCK1 mRNA和蛋白的表达情况;使用三种miRNA mimics分别转染肝癌细胞系Hep G2、Hep3b,分别使用q RT-PCR和Western Blot检测转染前后细胞中SPOCK1 mRNA和蛋白的表达情况;使用双荧光素酶报告基因法确认SPOCK1是否为miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p共同的靶基因。4.使用SPOCK1质粒载体和si-SPOCK1质粒载体,将Hep G2和Hep3b细胞分别转染成SPOCK1高表达和低表达细胞。使用三种miRNA mimics分别转染上述SPOCK1高表达细胞,使用q RT-PCR和Western blot分别检测各组SPOCK1 mRNA和SPOCK1蛋白表达情况,使用MTT法和Transwell小室法检测各组细胞增殖活性和侵袭细胞数,使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。5.使用含三种miRNA成熟序列的pc DNA3.1质粒分别转染Hep G2细胞,使细胞中miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p表达分别上调,将miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p过表达的Hep G2细胞和普通Hep G2细胞分别注射至裸鼠背部,构建移植瘤模型,四周后处理动物,比较不同组移植瘤体积和重量,分别q RT-PCR和Western blot检测各组SPOCK1 mRNA和蛋白表达情况,明确miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p在体内能否抑制肿瘤生长,及其SPOCK1 mRNA和蛋白表达情况的不同。结果:1.与癌旁正常肝组织相比,miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p在肝癌组织中的表达明显下降;与HL-7702正常肝细胞系相比,Hep G2、Hep3b肝癌细胞系中miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p的表达明显下降。提示miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p在肝癌细胞中低表达。2.使用miRNA mimics分别转染Hep G2和Hep3b细胞系后,成功使miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p在Hep G2和Hep3b细胞系中相对表达水平上调。使用MTT比色法检测转染前后细胞的增殖活性,发现使三种miRNA表达上调后,Hep G2和Hep3b细胞的增殖活性明显下降;使用Transwell小室法检测转染前后细胞的侵袭细胞数,发现使三种miRNA表达上调后,Hep G2和Hep3b细胞的侵袭细胞数明显下降;使用流式细胞仪检测转染前后细胞的凋亡情况,发现使三种miRNA表达上调后,Hep G2和Hep3b细胞的凋亡明显增多。其中,同时转染三种miRNA mimics的Hep G2和Hep3b细胞,其增殖活性和侵袭细胞数下降最为明显,凋亡也最为显著。3.联合使用Target Scan、star Base和micro RNA.org三个数据库筛预测miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p共同的靶基因,选出SPOCK1、GED1、TRAF3和TAOK1四个可能的靶基因。使用RNA pull down法验证四个靶基因,确认SPOCK1是三种miRNAs共同靶基因的可能性最大。q RT-PCR和Western blot检测发现,肝癌组织中SPOCK1 mRNA和蛋白的表达较癌旁正常组织明显升高,Hep G2和Hep3b细胞中SPOCK1 mRNA和蛋白的表达较HL-7702细胞明显升高。转染三种miRNA mimics使Hep G2和Hep3b细胞中三种miRNA表达上调后,Hep G2和Hep3b细胞中SPOCK1 mRNA和蛋白的表达较转染前明显下降。进一步双荧光素酶报告基因检测证明,SPOCK1 mRNA可与miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p匹配结合,是三种miRNA共同的靶基因。4.使Hep G2和Hep3b细胞中SPOCK1基因过表达,可增强其增殖活性,增加其侵袭细胞数,抑制细胞凋亡;敲除SPOCK1基因后,肿瘤细胞增殖活性明显下降,侵袭细胞数明显减少,细胞凋亡明显增加。分别上调SPOCK1过表达的Hep G2和Hep3b细胞中miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p的表达,可抑制其细胞增殖活性,减少侵袭细胞数,并使凋亡细胞增加。5.与未转染的NC组比较,miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p过表达的实验组移植瘤的体积较小,重量较轻,差别有统计学意义。与未转染的NC组比较,miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p过表达的实验组移植瘤中SPOCK1 mRNA和蛋白的表达均明显下降。结论:1.miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p在肝癌细胞中低表达,其表达程度与肝癌细胞增殖活性和侵袭力负相关,与肝癌细胞凋亡正相关;2.SPOCK1 mRNA和蛋白在肝癌细胞中高表达,其表达程度与肝癌细胞增殖活性和侵袭力正相关,与肝癌细胞凋亡负相关;3.SPOCK1是miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p共同的靶基因,miR-139-5p,miR-940和miR-193a-5p通过靶向SPOCK1抑制肝癌细胞的增殖、侵袭,诱导肝癌细胞凋亡。