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目的:研究cyclin D1,CDK4,P16及Rb基因在砷诱发HaCaT细胞恶性转变过程中的表达及意义。
方法:应用低浓度砷剂(100nM)长期作用于HaCaT细胞20周,观察细胞形态学改变,应用软琼脂克隆形成实验观察单克隆形成情况,应用Real Time-PCR检测MMP-9表达水平,以构建砷致HaCaT细胞恶性表型细胞。应用Real Time-PCR检测砷致HaCaT细胞恶性转化过程中,不同时间点(0周,6周,15周,20周)cyclinD1,CDK4,P16及Rb基因mRNA表达水平。
结果:
1.成功构建砷致HaCaT细胞恶性表型细胞
砷剂长期低浓度(100nM)作用于HaCaT细胞20周,细胞显示了形态学上的改变,即单个细胞边界不清,形态多样,伸展性差,细胞体积变小,频繁出现多核巨细胞。软琼脂克隆形成实验计算单克隆体形成率,砷剂组单克隆体形成率(0.67‰)明显多于对照组(0.16‰)(P＜0.05)。Real Time-PCR检测显示砷剂组(20周)基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA表达水平显著高于对照组。
2.CDK4/cyclinD1/p16/Rb通路中各基因mRNA水平表达改变
(1)P16 mRNA表达水平:与正常对照组(0周)HaCaT细胞相比,砷剂组第6周,15周,20周HaCaT细胞P16 mRNA表达均显著高于正常对照组(P＜0.05)。P16mRNA最高表达水平出现于第6周,于15周,20周明显回落。
(2)Rb mRNA表达水平:与正常对照组(0周)HaCaT细胞相比,砷剂组第6周,15周,20周HaCaT细胞Rb mRNA表达均显著高于正常对照组(P＜0.05)。Rb mRNA最高表达水平出现于第6周,于15周,20周Rb mRNA表达水平回落,但仍显著高于正常对照组(P＜0.003,P＜0.004)。
(3)CDK4 mRNA表达水平:与正常对照组(0周)HaCaT细胞相比,砷剂组第6周,15周,20周HaCaT细胞CDK4 mRNA表达均显著高于正常对照组(P＜0.05)。CDK4 mRNA表达于第6周出现显著高水平表达,于第15周CDK4 mRNA表达回落,但与正常对照组(0周)相比,仍显著升高(P＜0.009)。于第20周CDK4 mRNA表达又回升,且高于第6周CDK4 mRNA表达。
(4)cyelin D1 mRNA表达水平:与正常对照组(0周)HaCaT细胞相比,砷剂组第6周,15周,20周HaCaT细胞cyclin D1 mRNA表达均显著高于正常组(P＜0.05)。Cyelin D1 mRNA最高表达水平出现于第6周,于第15周cyclin D1 mRNA表达回落,但仍显著高于正常组(0周)(P＜0.007)。第20周cyclin D1 mRNA表达又略有上升。
结论:
1.应用低浓度砷剂长期作用于HaCaT细胞20周即可发生恶性转化。细胞形态学上改变为单个细胞边界不清,形态多样,伸展性差,细胞体积变小,频繁出现多核巨细胞。软琼脂实验单克隆体形成增多。MMP-9表达显著增高。
2.细胞周期调控p16-cyclin D1/CDK4-pRb途径在砷诱发人类皮肤癌过程中发生异常。
3.砷诱发HaCaT细胞恶性转变过程中,在早期P16,cyclin D1,CDK4,Rb mRNA水平表达即显著升高,提示p16-cyclin D1/CDK4-pRb途径各相关基因mRNA水平改变是一早期分子事件。
4.砷诱发HaCaT细胞恶性转变过程中不同时间点cyclin D1,P16,CDK4,RbmRNA表达水平各有不同变化,表明在细胞增殖,分化及恶性转化过程中其作用可能有所差异。为研究砷致皮肤癌的分子机制、早期诊断、预防和筛选药物干预靶点提供理论依据。