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背景条纹斑竹鳘(Chiloscyllium plagiosum)单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs)是目前发现的最小且完整的抗原结合片段,分子量低至12kDa左右。因其分子量小、稳定性好、抗原结合力强等一系列特点,使其可以穿过血脑屏障、用作sdAbs分子探针,以及在癌症治疗、分子诊断和显影等方面都有应用优势。且可实现重组表达,生产周期和生产成本均可大幅下降,是目前国内外研发的热点。目前软骨鱼类中研究较多的是护士鲨sdAbs,条纹斑竹鲨sdAbs的研究报道较少。目的筛选出至少一个Chiloscylliumplagiosum的sdAb;运用生物信息学手段对其空间结构进行预测并分析其潜在功能;对筛选获得的sdAbs进行重组表达,并对重组sdAbs抑菌活性进行初步研究,为sdAbs或纳米抗体(Nanobodies,Nbs)药物研发提供新技术手段。方法为了增加筛选抗体的多样性与丰富度,选用常见于海产品的典型致病菌——副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytius,VP)和实验室常用菌种——大肠杆菌TG1作为免疫源,接种Chiloscyllium plagiosum。接种菌液都用PBS缓冲液重悬,终浓度调整为 5.0×107 cfu/mL。首先对 6 条 Chiloscyllium plagiosum 分成 3组,每组2条,然后通过皮下注射进行接种。第1组均接种200 μL PBS缓冲液作为对照,第2组分别接种200 μL VP和200 μL灭活VP(VP(D)),第3组分别接种200 μL大肠杆菌TG1和200μL灭活大肠杆菌TG1(TG 1(D))。观察细菌接入后鲨鱼的生长状况、生理反应等。接种后第30天,进行二次接种,第60天对其进行解剖,观察其脾脏和肝脏的病变情况,分别进行脾脏和肝脏病理切片分析。同时,对脾脏细胞和血细胞进行转录组测序分析。并对鲨鱼血清进行定量蛋白质组学分析,同时对差异表达蛋白进行功能富集分析,初步判定与鲨鱼免疫相关的蛋白亚细胞定位、细胞免疫信号通路参与情况等。一轮筛选:利用血清蛋白质谱测序结果与脾脏细胞和血细胞的转录本库Summary-4_cds-Trinity_gene_pep中蛋白序列进行比对,确定其对应的基因名称、脱氧核苷酸序列等,再通过基因分析、功能注释和BLAST等方法全方位解析血清蛋白,进而筛选出抗体基因。二轮筛选:运用蛋白结构同源-建模服务器SWISS-MODEL分别对筛选出的抗体进行结构预测,并对每个模拟出的结构进行评估,深入解析,选出综合评估最高的结构作为后续研究的参考。最后,对选出的鲨鱼sdAbs作进一步研究。三轮筛选:将鲨鱼sdAbs基因克隆至pET-duet-His-SUMO载体上,转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化,然后进行定量分析,通过抑菌活性分析筛选出有活性的鲨鱼sdAbs。结果获得了一个包含53585个基因的鲨鱼转录本库,库中42%的基因长度分布在200-300 bp之间,说明鲨鱼基因普遍较短。对鲨鱼血清蛋白质谱数据分析,共获得1466个蛋白质定量信息。运用生物信息学方法成功分析筛选出51条鲨鱼抗体。明确了鲨鱼抗体的核酸序列、氨基酸序列及蛋白分子量大小等信息。在SWISS-MODEL建模服务器中,预测出16条目标鲨鱼sdAbs的结构模型,并进行结构评估。成功表达纯化出一条重组鲨鱼sdAb——Comp39220_c0-sdAb,初步探究发现,该抗体可以明显抑制VP的生长,对TG1也有一定的抑制作用。结论筛选出一条鲨鱼单域抗体Comp39220_c0-sdAb,并在体外重组表达,所获重组抗体对VP具有明显抑菌活性,提示该sdAb可能是VP免疫鲨鱼后产生的特异性抗体。