条纹斑竹鲨肝脏环形RNA(circRNA)筛选、鉴定及功能初步研究

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背景:条纹斑竹鲨因其独特的生长环境导致其肝脏内小RNA种类比较丰富。环形RNA(circ RNA)是一种缺少5’(帽)和3’(聚腺苷酸)尾巴并通过共价健结合形成的闭环非编码RNA,在多种物种中被发现且具有重要调控功能,肝癌的发生、发展与circ RNA关联密切,circ RNA可被视为癌症生物标志物。但鲨鱼肝脏组织中潜在的circ RNA尚未报道,探索鲨鱼肝脏circ RNA对于理解circ RNA在鲨鱼肝脏的组织分布特征具有一定的价值,识别和发现这类circ RNA将为进一步探索其在肝脏组织中的调控功能奠定基础。目的:筛选和验证条纹斑竹鲨肝脏中的circ RNA组织分布特征;根据circ RNA-mi RNAm RNA互作机制,分析circ RNA在肝癌细胞系中的潜在调控功能;探究circ RNA过表达对肝癌细胞Hep G2的增殖、迁移能力的影响。方法:抽提条纹斑竹鲨肝脏总RNA,进行circ RNA高通量测序,对测序数据运用FindCIRC软件预测进行circ RNA预测,通过设计正、反向引物对潜在circ RNA进行RT-PCR扩增鉴定,并对扩增产物进行核酸测序,验证其真实性;将预测到能相互靶定的circ RNAs目的片段构建双荧光素酶表达载体,运用双荧光素酶报告基因探究circ RNA和mi RNA的靶向性,进一步阐明circ RNA调控途径和功能;通过构建circ RNA过表达载体,瞬时转染到肝癌细胞株Hep G2中,进行q RT-PCR检测circ RNA表达量,CCK-8和划痕功能实验,研究circ RNA对肝癌细胞的潜在生物功能。结果:1)高通量测序获得6412万个原始reads。通过分析发现circ RNA在条纹斑竹鲨染色体上的分布并不均匀。在预测的circ RNA近一半的长度超过10000 bp,可能是基因组注释的不完整或鲨鱼circ RNA的原长所致,通过Find-CIRC软件预测到有4558条circ RNAs,筛选46条进行RT-PCR鉴定,确认了21条可以稳定扩增且测序结果与预期相符的circ RNAs;2)双荧光素酶报告基因检测结果证明了两条circ RNAs与mi RNAs:38-1717与ipumi R-143,6-1096与dre-let-7a能相互作,具有靶向性;3)在肝癌细胞Hep G2中瞬时过表达了13-566、4-475、5-402、294-177、30-219,q RTPCR结果表明均可瞬时表达。CCK-8和划痕功能实验结果显示,五种circ RNAs过表达后,均能显著地抑制肝癌细胞的增殖能力和迁移能力,其中4-475、294-177尤为明显。这为深入研究条纹斑竹鲨肝脏中circ RNA在肝癌治疗方面的功能提供了新思路。
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