背景:免疫球蛋白新抗原受体(Immunoglobulin New Antigen Receptor IgNAR)是已知的除骆驼重链抗体之外的另一种重链抗体,存在于软骨鱼类中,在护士鲨(Ginglymostoma cirratum)中首次被分离出来,后续又在条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)这种浅海底栖小型鲨鱼体内被发现。IgNAR中的可变结构域(VNAR)是目前已知的最小的抗原结合区域,因其分子量小,稳定性高,结合能力强,能透过血脑屏障等一系列优点而备受关注。目前市场上无商业化产品,但因其结构简单、制备容易、生产周期短而具有很大的开发潜力,目前关于条纹斑竹鲨中IgNAR的研究相对较少,且没有关于抗乙肝表面抗原(HBsAg)的VNAR的相关报道,利用鲨鱼免疫特点,探究制备HBsAg的单域抗体具有积极的临床应用愿景。目的:获得完整的条纹斑竹鲨IgNAR序列,并在其完整序列的基础上对其可变区和恒定区的序列特点进行分析,对其结构进行预测和生物信息学分析。通过对条纹斑竹鲨免疫乙肝表面抗原ad亚型(HBsAg-ad),将转录组高通量测序、质谱检测和针对鲨鱼IgNAR V区的高通量测序相结合,至少获得一个能够与HBsAg-ad结合的VNAR,为VNAR的筛选提供一个新思路。方法:通过对野生条纹斑竹鲨的脾脏和淋巴细胞进行转录组高通量测序,对测序所得序列进行组装并注释,最终期望能够获得一条完整的条纹斑竹鲨可分泌IgNAR(IgNAR Sec)序列,以此序列为基础,分别对IgNAR Sec的全长、可变区(V)和恒定区(C)进行扩增。首先检测条纹斑竹鲨体内的IgNAR Sec共有多少同种型;然后针对IgNAR Sec C1区进行扩增确定C1区序列的种类并针对IgNAR Sec C1-C5区域进行扩增确定完整恒定区的情况;最后针对IgNAR Sec VNAR区域进行高通量测序,确定每种VNAR所占比例,通过以上研究对IgNAR Sec特点有一个整体认识。为获得可识别HBsAg的VNAR,选用在亚洲流行较广HBsAg-ad进行免疫。首先根据野生鲨鱼的状态将其饲养7天左右以适应新的生活环境,然后选三只生长状态良好的鲨鱼,其中两只鲨鱼免疫HBsAg-ad 10μg和LPS 10μg,一只鲨鱼免疫LPS 10μg作为对照。共免疫4次,每次免疫相隔15天,三只鲨鱼免疫前取血作为对照,并且免疫HBsAg-ad的鲨鱼每次免疫后间隔取血以监测抗体产生情况。首次免疫60天后,取鲨鱼脾脏和淋巴细胞进行转录组测序、取免疫后鲨鱼的血清进行质谱检测并提取免疫鲨鱼脾脏和淋巴细胞RNA进行RT-PCR获得仅含鲨鱼VNAR区域的高通量数据库。将获得的转录组高通量测序结果与VNAR区域的高通量数据库进行比对,筛选在两个数据库中均含有且含量较多的序列;另一方面将质谱结果与鲨鱼VNAR区域的高通量数据库进行比对,筛选在两个数据库中均含有且含量较多的序列。结合两个筛选结果获得可能的VNAR序列,将这些序列克隆到p ET-22b质粒上,在大肠杆菌中进行重组表达,获得重组VNAR,然后通过ELISA检测确定重组VNAR对HBsAg-ad是否具有结合活性。结果:1)确定条纹斑竹鲨的IgNAR Sec具有两种形式,一种含有5个恒定区,另外一种含有3个恒定区,其中含有3个恒定区的IgNAR Sec是在条纹斑竹鲨中确定的一种新的剪接形式;2)确定IgNAR Sec C1区有两种,通过结构预测发现其中一种较另外一种缺少一个α-螺旋,同时缺少螺旋的结构在鲨鱼体内含量更少;3)通过对IgNAR Sec V区进行高通量检测,对条纹斑竹鲨的VNAR进行分类并获得不同种类的抗体所占比例,发现其占比情况与护士鲨中IgNAR不同种类占比情况不同;4)通过免疫鲨鱼,获得免疫后鲨鱼的转录组文库,并在其中筛选到免疫相关的m RNA序列,获得免疫后鲨鱼血清的质谱数据,并在其中筛选到免疫相关的肽段,通过将以上两个数据库与免疫鲨鱼的VNAR高通量数据进行比对,最终获得10条可能的相关VNAR序列,并通过筛选最终筛选出5条与HBsAg结合活性较好的序列。结论:通过以上研究找到了对HBsAg-ad具有较好结合活性的VNAR,为开发乙肝单域抗体治疗药物研究提供了新途径。