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背景:免疫球蛋白新抗原受体（Immunoglobulin New Antigen ReceptorIgNAR）是鲨鱼免疫系统的一类Ig样分子,仅以重链的同型二聚体形式存在,并通过其单个结构域可变区（VNAR）结合抗原。鲨鱼中可生成可溶性高、稳定强且特异好的VNAR,大小可低至约12 kD。TNFα是典型的促炎细胞因子,在多种慢性炎症性和自身免疫性疾病的发生和发展中起核心作用。靶向TNFα作为一种治疗手段已经取得了巨大的成功,但目前的TNFα生物药物均存在明显局限性,开发鲨鱼单域抗体对研发TNFα靶向药物提供了新思路。目的:以条纹斑竹鲨为研究对象,获得免疫前后脾脏、血液转录组数据、VNAR高通量测序结果,利用生物信息学方法筛选hTNFα特异性的VNAR序列。通过活性研究筛选高活性、高特异性的目的VNAR,为hTNFα体研究提供新思路及候选药物。方法:原核表达hTNFα基因,亲和层析纯化蛋白,利用L929细胞检测重组蛋白活性,获得重组hTNFα。实验组与对照组分别使用重组hTNF α、PBS与弗氏不完全佐剂混合乳化后免疫条纹斑竹鲨,免疫周期为30天,免疫时长为4个月,免疫前及免疫期间共取血4次。免疫结束后,解剖取出脾脏,将部分脾脏与血液样本进行转录组测序。剩余脾脏样本进行RNA提取,VNAR特异性扩增及高通量测序后建立VNAR基因组文库。利用BioEdit、SWISS-MODEL等生物信息学工具对转录组蛋白文库及基因组文库进行筛选,得到目的VNAR序列。将VNAR序列进行原核重组表达、纯化得到足量蛋白。ELISA检测VNAR与hTNFα结合能力与特异性,用L929细胞株评价VNAR对hTNFα细胞毒性的中和效果。结果:1)纯化获得17 mg hTNFα重组蛋白,重组hTNFα对L929细胞EC50值为0.24 ng/mL。2)脾脏转录组测序得到拼接序列72872条、氨基酸编码序列16378条,血浆转录组测序得拼接序列95537条、氨基酸编码序列17106条。进一步筛选得到免疫后持续上调基因915个,对应的氨基酸序列建立转录组蛋白质文库。3)VNAR高通量测序得到814884条基因序列,结果建立基因文库,结合生物信息学方法及转录蛋白文库筛选得到12条单域抗体序列。4)ELISA活性检测得到12条VNAR序列均有较好的hTNFα结合活性,和较高的结合特异性。5)hTNFα体外中和实验显示,7个VNAR蛋白对hTNFα细胞毒性具有一定中和效果,可进一步进行人源化改造,为hTNFα靶向研究提供候选药物。