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背景:单域抗体(Single-domain antibodies,sd Ab)是一类具有较强的组织穿透性、稳定性和亲和力的小分子抗体,能够实现药物脑部靶向运输以及与抗原隐藏表位的结合。最初是通过改造从骆驼血清中提取的重链抗体而获得的,之后随着护士鲨、大星鲨、条纹斑竹鲨等软骨鱼类中重链抗体(Ig new antigen receptor,Ig NAR)的发现,一种新的鲨鱼来源的单域抗体VNAR(Variable domain of Ig new antigen receptor,VNAR)被获得。作为科学研究的新型抗体,目前对VNAR的研究显示,其在医学影像学、靶向治疗、快速诊断等领域都展现了显著的优势,具有广泛的应用潜能和极大的经济价值。近年来,随着噬菌体展示文库以及高通量测序技术不断升级,使得VNAR的生产周期被缩短、生产成本大幅下降,这引发了VNAR的研究热潮。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、肠炎和猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis nephropathy syndrome,PDNS)等疾病的主要病因,其广泛流行于全球养猪业中,发病后病死率可达40%,给养猪业带来巨大的经济损失。Cap蛋白(Capsid protein,Cap)是由PCV2基因组开放阅读框(Open reading frame,ORF)2编码的结构蛋白,能够刺激机体产生中和活性抗体,常用于PCV2的血清诊断试剂以及防预疫苗的开发,故开展针对Cap蛋白的单域抗体研究具有重要的现实意义。目的:本课题旨在以条纹斑竹鲨作为VNAR研究的模式生物,将Cap蛋白免疫鲨鱼,以期获得针对Cap蛋白的单域抗体,为PCV2感染的快速检测提供新的方案和物质基础。最终期望利用生物信息学方法建立一种方便、快速筛选特异性VNAR的技术平台,为筛选VNAR提供新的技术思路,同时探索VNAR在大肠杆菌中高效表达和快速纯化的方法,为VNAR的应用提供支持。方法:将在福建省漳州市近海捕获的条纹斑竹鲨在实验室驯养1周,再随机分为实验组和对照组,利用1 mg/m L Cap蛋白和弗氏佐剂对实验组鲨鱼进行免疫,利用鲨鱼生理盐水和弗氏佐剂对对照组鲨鱼进行免疫,总共5次免疫,每次间隔2周,诱导鲨鱼产生针对Cap蛋白的特异性抗体。免疫完成后对鲨鱼进行解剖,收集脾脏和全血样本进行转录组测序。利用基因表达差异分析转录组数据,筛选出表达上调的基因,再通过基因注释和功能富集,将表达上调基因中与免疫球蛋白相关的基因富集,以期获得Cap免疫后表达上调的免疫球蛋白相关基因。根据免疫球蛋白相关基因中的Ig NAR序列,设计Ig NAR可变区(VNAR)序列的简并引物,扩增出脾脏和全血中的VNAR序列,并对扩增产物进行了高通量测序,构建VNAR文库。通过抗原制备的亲和纯化柱将抗血清中的抗体富集,富集后的抗体上质谱分析仪,获得抗体的肽段信息,利用序列比对软件与之前构建的VNAR文库以及表达上调的免疫球蛋白相关基因序列匹配,筛选目标抗体。利用p ET-22b表达载体构建重组质粒,诱导目标抗体在大肠杆菌中进行表达,通过Ni柱纯化获得重组抗体,用双抗夹心法检测重组抗体的结合活性。结果:1)成功构建了包含143537条唯一基因的转录组文库和3822条VNAR基因的VNAR文库,为条纹斑竹鲨的免疫研究打下基础。2)利用Cap抗原制备Cap蛋白特异性抗体亲和纯化柱,成功从被Cap蛋白免疫的鲨鱼血清中纯化出能与Cap特异结合的抗体,建立了鲨鱼抗血清的纯化方法,为VNAR的研究提供技术支持。3)筛选出8条能够与Cap蛋白特异结合的单域抗体,最后成功纯化并获得Shark-1171-sd Ab、Shark-4598-sd Ab、Shark-12458-sd A、Shark-22244-sd Ab4条具有较强抗原亲和力的VNAR序列。结论:Cap蛋白免疫条纹斑竹鲨后,利用高通量测序结合质谱分析可以筛选到有效的VNAR序列,且该序列可以在大肠杆菌中高效表达,所获得重组单域抗体具有较强抗原亲和力。