目的:肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）最近被称为“第二脑”,是由起源于肠神经嵴干细胞（Enteric neural crest stem cells,ENCSCs）的神经元和神经胶质细胞聚集而成,在胃肠道内形成相对独立的神经网络。ENS发育异常可能会导致儿童期部分消化道畸形相关疾病,也可能会导致成年期胃肠动力紊乱以及功能性胃肠病。ENS发育异常引起的疾病从肠神经元的数量和质量上可以分为3种:肠神经元缺失（先天性巨结肠）,肠神经元发育不良和肠神经节细胞数量减少等。其中,以先天性巨结肠病（Hirschsprung,HD）最为常见。HD是一种常见的先天性肠道运动障碍性疾病,主要特征是远端结肠神经节细胞缺如引起肠壁痉挛,使近端结肠内粪便通行受阻导致近端肠壁扩张,主要症状是便秘,发病率约为1/5000。目前作为该病疗效确切的唯一治疗方法HD肠远端神经节缺如节段的手术切除虽可降缓解便秘症状,但并发症较多,影响患儿以后的生活质量。所以,深入探究HD的发病机理并基于此找出更好的治疗方法意义十分重大。据报道,ENS发育异常是由于胎儿发育期间ENCSCs迁移受损而导致的,这也是HD患者病变肠段神经节缺如的主要原因。目前一致认为神经嵴干细胞迁移学说较准确地描述了 ENS发育的整个过程:ENCSCs沿肠道的增殖和迁移;ENCSCs定植后向神经元和胶质细胞的分化;在肠壁内形成神经节;神经元轴突和突触的形成等。已知神经嵴细胞（neural crest stem cells,NCSCs）在胚胎发育时期从背侧神经嵴褶皱处分离并开始向中胚层间充质定向迁移的旅途,最后在间充质中定植。其中部分NCSCs定向分化为ENS的神经元和神经胶质细胞,被称为ENCSCs。ENCSCs沿肠道迁移、定植、分化最终发育形成ENS。上述生理过程涉及的分子调控机制十分复杂,NCSCs迁移的动力源并不十分明确。目前,趋化作用（Chemotaxis）和上皮间充质转化（Epithelia-mesenchymal transition,EMT）已被明确认为是促进细胞迁移和增殖的重要机制。课题组前期应用免疫荧光技术对大鼠胚胎切片进行染色分析,证实ENCSCs表面均表达CXCR4,CXCR4诱导NCSCs沿着SDF-1的浓度梯度从神经嵴向肠道迁移,说明SDF-1/CXCR4轴在NCSCs迁移过程中发挥调控作用;同时,课题组在大鼠胚胎提取的NCSCs中证实NCSCs在生长过程中E-cadherin表达降低,N-cadherin表达升高,提示EMT在NCSCs迁移过程中起到重要作用。但是,SDF-1/CXCR4轴和EMT介导细胞粘附、迁移和增殖等生物活动的具体调控机制目前尚不完全清楚,我们猜测它们之间存在相互作用的调控机制。微小RNA（microRNA,miRNA）是近年来发现的长度约为22nt的内源性短链RNA。miRNA通过与目标mRNA的3’端非翻译区（3’-UTR）互补结合发挥分子生物学作用,导致靶基因的翻译和表达在转录后水平受到调节。其在个体发育、细胞分化及凋亡等众多生理活动中都发挥着重要调控作用,并与多种疾病的发生发展相关。目前已发现若干miRNAs在HD患者病变肠段中表达异常,miRNAs通过不同的机制对ENCSCs的增殖、迁移、分化及存活发挥调节作用,但仍有众多miRNAs有待被发现。因此,有必要对miRNA参与ENS的发育调控机制进行深入研究,以求发现起重要作用的miRNA分子,并在此基础上探索新的治疗靶点。本研究中,我们对比了 HD患者的病变肠组织和正常肠组织miRNA表达谱,结合生物信息学分析,寻找差异表达的miRNAs。而后选取大鼠ENCSCs表达CXCR4的高峰期（即胎龄12天）的胎鼠提取ENCSCs的原代细胞进行研究。通过腺病毒转染的方式使ENCSCs过表达关键miRNAs,并对其在细胞水平和分子水平进行研究,以期得到同时参与SDF-1/CXCR4轴与EMT过程的miRNAs并探讨其具体调控ENCSCs增殖、凋亡与迁移的机制。研究方法:1、高通量测序筛选HD患者的病变肠组织和正常肠组织中差异表达的miRNAs。收集3名HD患儿手术切除的肠组织,以病理科免疫组化检测无神经节细胞的痉挛段肠组织为病变组,有神经节细胞的扩张段肠组织为正常组。通过高通量测序技术筛选差异表达的miRNAs,对差异倍数较大的miRNAs进行GO、KEGG功能富集分析,筛选出可能同时参与细胞趋化性和EMT过程的miRNAs。采用RT-qPCR技术对重要的miRNAs进行验证。通过生物信息学数据库对重要的miRNAs进行靶基因预测。2、ENCSCs的提取、培养和鉴定。选用7-9周龄、体重230-280g健康性成熟未孕育的Wistar大鼠,由中国医科大学附属盛京医院实验动物饲养中心提供,并在SPF级动物饲养室饲养（室温22±2℃;湿度55±5℃;保持12小时昼夜循环）。按雌雄4:1比例午夜合笼,并于次日8:00-9:00进行阴道涂片,以光学显微镜下见大量精子者记为妊娠第0天（embryonic 0,E0）。待孕鼠妊娠第12天（E12）剖宫取胎,于显微镜下用显微器械取出胚胎肠管组织,经物理破碎和化学酶消化后,使用神经干细胞专用培养基重悬细胞并接种到培养瓶中,在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。原代孵育24h后弃去漂浮死细胞,以2/3量换液,继续培养,观察并用倒置显微镜观察细胞成神经球的情况。通过形态学鉴定和免疫学鉴定（免疫荧光和流式细胞术）对原代细胞进行鉴定。3、miR-383-3p、miR-490-5p、miR-200c-3p 和 miR-204-3p 对 CXCR4、ZEB2和E-cadherin表达量的影响。使用腺病毒转染大鼠ENCSCs进行实验。在分别过表达 miR-383-3p、miR-490-5p、miR-200c-3p 和 miR-204-3p 后,RT-qPCR 检测过表达效率并确定最佳转染浓度,并检测CXCR4、ZEB2和E-cadherin的表达水平。4、miR-204-3p对SP1表达量的影响。在大鼠ENCSCs中过表达miR-204-3p后,采用RT-qPCR检测SP1表达水平。5、miR-204-3p和SP1对大鼠ENCSCs细胞功能的作用。针对SP1设计3个siRNA并用腺病毒包装,转染ENCSCs后RT-qPCR检测干扰效率,选择干扰效果最佳的siRNA进行后续实验。过表达miR-204-3p或敲降SP1后,分别检测细胞增殖、细胞流式凋亡和细胞迁移能力的改变情况。6、SP1对CXCR4、E-cadherin和miR-204-3p表达量的影响。在干扰SP1后,RT-qPCR 检测 CXCR4、E-cadherin 和 miR-204-3p 的表达水平。7、CXCR4对大鼠ENCSCs细胞功能的作用。针对CXCR4设计3个siRNA并用腺病毒包装,转染ENCSCs后RT-qPCR检测干扰效率,选择干扰效果最佳的siRNA进行后续实验。敲降CXCR4后,检测细胞增殖、细胞流式凋亡和细胞迁移能力的改变情况。8、统计学分析。实验数据用均值±标准差表示,使用SPSS 21.0和Prism 7.0软件进行统计学分析。对于两组之间的比较,使用Student’s t检验;对于多组之间的比较,使用one-way ANOVA和Tukey post-hoc分析方法。P<0.05是认为统计差异显著。结果:1、高通量测序结果显示,HD患儿病变肠组织和正常肠组织中共得出277个显著上调的miRNAs和254个显著下调的miRNAs。选择差异倍数最高的 30 个 miRNAs 进行 GO 分析和 KEGG 分析,发现 miR-383-3p、miR-490-5p、miR-200c-3p和miR-204-3p同时与EMT和细胞趋化性有关。使用RT-qPCR验证这4个miRNAs的表达趋势,与测序结基本果一致。通过靶基因预测,发现miR-204-3p与靶基因联系最为广泛。2、在大鼠 ENCSCs 中分别过表达 miR-200c-3p 和 miR-204-3p 后,CXCR4和ZEB表达下降,E-cadherin表达上升;而分别过表达miR-383-3p和miR-490-5p后,CXCR4表达无明显变化,ZEB2表达下降,E-cadherin表达上升。3、在大鼠ENCSCs中过表达miR-204-3p后,SP1表达下降。4、在大鼠ENCSCs中过表达miR-204-3p后,可引起大鼠ENCSCs增殖能力减弱、凋亡增加、迁移能力减弱。敲降SP1后也有类似结果。5、在大鼠ENCSCs中敲降SP1后,CXCR4表达下降,E-cadherin表达上升,并且在敲降SP1后,发现miR-204-3p表达下降。6、在大鼠ENCSCs中敲降CXCR4后,可引起大鼠ENCSCs增殖能力减弱、凋亡增加、迁移能力减弱。结论:1、先天性巨结肠患儿病变肠组织和正常肠组织中存在较多差异表达的miRNAs,这些miRNAs可能与小儿先天性巨结肠的发生、发展有关,有待于进一步研究。2、过表达miR-204-3p或敲降SP1或敲降CXCR4后,大鼠ENCSCs增殖减弱、凋亡增加、迁移能力减弱,提示miR-204-3p、SP1和CXCR4均参与调控ENCSCs增殖、凋亡与迁移。3、miR-204-3p可能通过调控其潜在靶基因SP1参与SDF-1/CXCR4轴与EMT过程。