目的:人口老龄化是目前全球人口趋势,这给世界各国社会医疗、养老、劳动力、经济发展等方面带来诸多挑战,因此研究衰老导致的相关疾病具有十分重要意义。肾脏具有排泄代谢废物、维持水、电解质平衡的重要功能,其衰老对机体影响不容忽视。肾脏衰老包括随年龄增加导致的生理性衰老和由于一些疾病,如高血压、糖尿病等疾病导致的早老性衰老,它可增加慢性肾脏病（CKD）的发病率,给社会带来沉重的医疗负担。衰老在组织水平表现为DNA、蛋白质和脂质、细胞器损伤以及毒性修饰的聚集;而自噬正是一种涉及蛋白质和细胞器降解的细胞途径,它可维持细胞稳态,参与机体衰老、炎症、肿瘤、免疫等多种病理生理过程。STAT3作为JAK/STATs通路的重要成员,参与多种肾脏疾病的发生及自噬、衰老等过程。肾素-血管紧张素-醛固酮系统是维持肾脏正常生理功能的主要系统,其异常亦可导致多种肾脏疾病的发生,该系统的主要效应因子为血管紧张素II（Ang II）。STAT3参与调控的自噬在血管紧张素II诱导的肾小管上皮细胞衰老过程中的作用尚未阐明。因此本文着重于研究血管紧张素II诱导的肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3通路、自噬参与的调控作用和机制,并观察应用血管紧张素II受体拮抗剂氯沙坦在改善肾小管上皮细胞衰老过程中的作用和机制,并在小鼠体内进行验证,以期为延缓肾脏衰老、慢性肾脏病防治提供策略。研究方法:1.建立血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞衰老模型并观察自噬在其衰老过程中的变化及对衰老的影响。应用10-6mol/L浓度的Ang II作用于人HK-2细胞0h至72h,采用流式细胞术检测细胞周期、Western blot法检测衰老相关蛋白P21表达水平、衰老相关β-半乳糖苷酶染色（SAβ-gal）检测衰老细胞阳性率方法以建立人肾小管上皮细胞衰老模型。此后应用Ang II、3-MA作用于人HK-2细胞,并应用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3II、P62、衰老相关蛋白P21表达水平、电镜检测自噬体数量、LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染及激光共聚焦显微镜观察自噬光斑数量、SAβ-gal检测衰老细胞阳性率,以观察Ang II诱导的人肾小管上皮细胞自噬的变化及对衰老的影响。2.调控STAT3通路并观察其在血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞衰老过程中的作用及氯沙坦干预对人肾小管上皮细胞STAT3通路、自噬、衰老的影响。应用Ang II诱导人肾小管上皮细胞衰老,使用Western blot法检测STAT3/PI3KC3通路变化,并应用S3I-201药物阻断及si RNA-STAT3基因阻断STAT3并应用Western blot法观察p STAT3蛋白、PI3KC3蛋白、衰老相关蛋白P21、自噬相关蛋白LC3II、P62表达水平、电镜检测自噬体数量,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染观察自噬光斑数量、β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞阳性率等指标。在Ang II诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中应用氯沙坦处理人HK-2细胞,并应用Western blot法观察p STAT3、P21、LC3II、P62表达水平、电镜检测自噬体数量,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染观察自噬光斑数量、SAβ-gal染色检测衰老细胞阳性率等方法观察氯沙坦对HK-2细胞STAT3通路、自噬、衰老的影响及作用。3.体内验证血管紧张素Ⅱ诱导小鼠肾脏衰老过程肾小管上皮细胞STAT3通路、自噬及衰老的变化及氯沙坦对其影响。18只雄性C57BL/6J小鼠适应性饲养1周后将小鼠随机分为3组,即:年轻对照组（小鼠不做任何处理,正常饲养4周）、Ang II组（输注Ang II:Alzet微渗透泵输注Ang II,以1000 ng/kg/min速率连续输注Ang II,共4周）、Ang II+氯沙坦组（输注Ang II+灌胃氯沙坦;Ang II通过Alzet微渗透泵以1000 ng/kg/min速率连续输注4周,开始输注2周后,开始给予氯沙坦以30 mg/kg/d给予小鼠连续灌胃2周）,每组均为6只。每周监测小鼠血压变化。第4周结束后收集小鼠血液、尿液标本并检测小鼠血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白、尿NAG变化,留取肾脏标本并采用Masson染色、SAβ-gal染色、免疫组化、Western blot法检测P21、LC3、p STAT3变化以观察小鼠肾脏STAT3通路、自噬、衰老变化。结果:1.血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中自噬活性增强并介导其衰老。10-6mol/L浓度的Ang II作用于人HK-2细胞,CCK-8法结果显示Ang II 0-72h促进人HK-2细胞增殖,此后抑制细胞增殖;细胞周期检测发现Ang II作用于人HK-2细胞72h后超过80%的细胞进入G0-G1期,显著高于正常对照组;Western blot结果显示,与正常对照组相比,人HK-2细胞衰老相关蛋白P21表达水平呈时间依赖性增加,72h时P21蛋白表达水平显著高于正常对照组;SAβ-gal染色发现,与正常对照组相比,人HK-2细胞β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率呈时间依赖性增加,48h、72h时与对照组相比均显著增加,72小时达最高值。应用10-6mol/L浓度的AngⅡ诱导人HK-2细胞衰老过程中,与正常对照组相比,Western blot结果显示自噬相关蛋白LC3II/LC3Ι比值呈时间依赖性增加、72h时与正常对照组相比显著增加,P62蛋白表达24h开始显著减少、72h达最低;电镜检测显示在72h时HK-2细胞自噬体数量明显增加;LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染显示在72h时HK-2细胞LC3荧光点数量显著增多。加入3-MA抑制人HK-2细胞自噬后,与Ang II组相比（72h）,Ang II+3-MA组Western blot结果显示LC3II蛋白表达明显下降,P62蛋白表达明显增多,P21蛋白表达明显下降,电镜检测自噬体数量明显减少,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染LC3荧光点数量显著减少,SAβ-gal染色细胞阳性率显著减少。2.血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3/PI3KC3通路激活,药物抑制和基因沉默STAT3表达可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小管上皮细胞自噬激活,减轻细胞衰老应用10-6mol/L浓度Ang II作用于人HK-2细胞,Western blot结果显示p STAT3蛋白在第24h开始呈时间依赖性表达增加,72h时p STAT3蛋白表达与正常对照组相比显著增加;随着p STAT3的激活,PI3KC3蛋白在48h开始表达显著增加,72h时表达显著高于正常对照组。提示血管紧张素II诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3/PI3KC3通路激活。在10-6mol/LAng II作用的人HK-2细胞中加入S3I-201、si RNA-STAT3、氯沙坦后,与Ang II组（72h）相比,Ang II+S3I-201组、Ang II+si RNA-STAT3组、Ang II+氯沙坦组Western blot结果显示p STAT3蛋白表达被显著抑制、LC3II蛋白表达明显下降、P62蛋白表达明显增加、P21蛋白表达明显下降,电镜检测发现自噬体数量均显著减少,LC3-GFP-m RFP自噬双标腺病毒转染LC3荧光点数量均显著减少,SAβ-gal染色阳性率均显著减低。3.氯沙坦可抑制血管紧张素Ⅱ诱导小鼠肾脏衰老过程中STAT3激活、自噬激活并延缓小鼠肾小管上皮细胞衰老Ang II诱导小鼠肾脏衰老过程中,随着小鼠周龄的增加,与年轻对照组相比,Ang II组小鼠收缩压及舒张压均逐渐增高,第4周龄时Ang II组小鼠收缩压、舒张压均显著高于年轻对照组,血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白、尿NAG均显著高于年轻对照组,Masson染色显示肾小管间质纤维化程度明显加重,β-半乳糖苷酶染色阳性率显著增加,免疫组化显示肾小管上皮细胞P21表达水平显著升高,p STAT3、LC3表达水平亦显著高于年轻对照组,Western blot结果显示肾小管上皮细胞P21蛋白表达水平显著升高,p STAT3、LC3蛋白表达水平亦显著高于年轻对照组。而应用氯沙坦后,在第4周龄时,与Ang II组相比,Ang II+氯沙坦组小鼠收缩压、血尿素氮、24h尿蛋白、尿NAG均显著下降,但舒张压、血肌酐下降无统计学差异,Masson染色显示肾小管间质纤维化程度明显减轻,SAβ-gal染色阳性率显著下降,免疫组化显示肾小管上皮细胞P21表达水平显著减低、p STAT3、LC3表达水平显著下降,Western blot结果显示肾小管上皮细胞P21蛋白表达水平显著下降,p STAT3、LC3蛋白表达水平显著下降。结论:1、Ang II可通过促进自噬的方式诱导人肾小管上皮细胞衰老,使用3-MA抑制自噬、可减轻Ang II诱导的人肾小管上皮细胞衰老。2、Ang II诱导人肾小管上皮细胞衰老过程中STAT3/PI3KC3通路激活,S3I-201、si RNA-STAT3、氯沙坦均可通过抑制STAT3的激活,进而抑制Ang II诱导的人肾小管上皮细胞自噬并减轻细胞衰老。3、STAT3通路及自噬激活参与了Ang II诱导的小鼠肾小管上皮细胞衰老过程,氯沙坦可抑制此过程中STAT3的激活、抑制自噬过度激活并延缓小鼠肾小管上皮细胞衰老,为第一部分和第二部分论文提供了体内验证支持。