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目的:嗜肺军团菌（Legionella pneumophila,LP）是一种在自然界和人工供水系统中普遍存在的革兰氏阴性短小球杆菌,在1976年美国退伍军人大会引起爆发,221人感染,34人因军团菌肺炎死亡,后在尸检组织中分离出该菌而命名。军团菌可通过雾化的水颗粒传播,它是社区获得性和医院获得性肺炎的病原菌之一。军团菌由56种以上组成,LP是最常见的种,它引起了90%的军团菌病病例,其中血清群1、4和6被认为人类疾病的主要致病菌,报告病例中80%的病例为LP血清1型引起。无论是散发的或者爆发、社区获得或者医院获得,军团菌均可造成致命性感染,在免疫力低下的病人中更是如此。如果没有得到及时和正确的治疗,LP感染所致的死亡率可高达50%。除了监控环境军团菌之外,针对易感人群尚无理想的预防感染的有效措施。因此,研发安全有效且没有毒副作用的疫苗对抗LP感染具有重要意义。疫苗的开发一直是现代医学的重大进步,同时提高了公共卫生的水平并延长了人类寿命。研究证明DNA疫苗被证明是通过将遗传物质直接注射入活体宿主中后,提供有效的保护性免疫,与常规疫苗相比,制备过程更简单,稳定性、安全性更好,诱导免疫反应的能力更强。与传统疫苗不同,DNA疫苗是携带特定的编码基因的细菌质粒,这些细菌质粒负责宿主中抗原的表达和诱导免疫反应。DNA疫苗可以引发体液和细胞免疫反应,这是优于常用疫苗的重要优势。军团菌的疫苗到现在研究比较多的DNA疫苗,为军团菌的疫苗制备提供新思路。DNA疫苗的载体最常用的是pc DNA质粒系列,pc DNA3.1（+）是真核表达载体中比较常见的。将p DNA与适宜的载体相结合,可提高输送效力,不仅改善质粒稳定性,也可以增强基因表达和免疫反应。本研究中PAL蛋白是革兰氏阴性菌重要的外膜蛋白质之一,几乎所有研究的PAL蛋白都是高免疫原性,使之成为疫苗生产的良好候选抗原。查阅文献,序列分析PAL基因在各种LP中均有高度保守性,PAL和脂肽类似物一样,能激活细胞免疫和体液免疫。目前已知的LP毒力因子有FlaA,IP,LPS,Mip,Momp S和PilE等,这些毒力因子促进LP与宿主细胞黏附、侵袭和定植,同时促进LP在宿主内的生长和繁殖。FlaA编码嗜肺军团菌鞭毛蛋白,鞭毛蛋白除具有结构蛋白的作用外,还具有效应因子的功能。FlaA具有很强的免疫原性,可以刺激T细胞介导的细胞免疫应答,当受到致死剂量的军团菌攻击恢复后起到保护作用。PilE基因编码LP的IV型菌毛蛋白,PilE基因表达增强,军团菌在宿主细胞及水环境中的生长将增强。IV型菌毛的表达也与LP中DNA转化的能力有关。PilE和FlaA是嗜肺军团菌的重要附着因子和保护性免疫原,可避免产毒菌株的攻击。我们培养了嗜肺军团菌菌株,检测菌株的毒力,并重组PAL,PilE和FlaA基因片段,用特定的Linker（FlaA—Linker:（G4S）3—PilE—Linker:EASPPGE—PAL）构建到真核表达载体pc DNA3.1上,分别获得PAL,PilE,FlaA和PAL/PilE/FlaA重组质粒。同时,我们还用Western Blotting法检测了转染293细胞的质粒扩增的表达,用于进一步评价重组PAL/PilE/FlaA DNA在对嗜肺军团菌感染的疫苗保护作用提供工作基础及参考。研究表明DNA疫苗的免疫保护力,也受到接种途径和方法的影响。多项研究表明肌肉注射产生的免疫保护效果最好。应用注射的目的是把DNA质粒递送至次级淋巴器官中的抗原递呈细胞,因此,本研究中将重组质粒pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-Pi IE、pc DNA3.1-FlaA、pc DNA3.1-PAL/Pi IE/FlaA肌肉注射进小鼠体内,产生免疫保护。通过肌肉注射DNA疫苗,在肌细胞中会存在持久的抗原表达,该抗原能诱导T细胞增殖、细胞因子释放和抗体产生,特别是诱导细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用。本研究结果显示在BALB/c小鼠的动物实验中,重组PAL/PilE/FlaA DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠后的反应表明,疫苗引起的Ig G抗体免疫记忆迅速被诱导。军团菌、布氏杆菌、结核分枝杆菌、伤寒杆菌以及病毒等均为胞内寄生菌,在人和小鼠的免疫反应中,细胞毒性T淋巴细胞对于清除胞内菌具有十分重要的生物学意义。本研究中三种单价DNA疫苗和重组DNA疫苗均可诱发CTL杀伤活性,均明显高于pc DNA3.1空载质粒组。既往已有文献提出病原微生物侵入机体后,免疫应答中Thl细胞和Th2细胞中的优势细胞,决定了机体针对抗原发生的免疫应答是以细胞免疫为主还是以体液免疫为主。国外有报道,细胞免疫和细胞因子的产生在嗜肺军团菌病的保护中起重要作用。本研究中,我们发现血清中TNF-α、IFNγ和IL-10的水平升高,在脾细胞的上清液中用重组PAL/PilE/FlaA DNA疫苗进行免疫后,TNF-α、IFNγ、IL-12、IL-4和IL-10的水平显著增高,由此可见,重组PAL/PilE/FlaA DNA疫苗可以诱导小鼠的Th1和Th2免疫反应。此外,接种了重组PAL/PilE/FlaA DNA疫苗的小鼠的生存时间和组织病理学改变明显改善。因此,重组PAL/PilE/FlaA DNA疫苗可诱导小鼠产生抗LP感染的保护性免疫。研究方法:1、Western-blotting法检测pcDNA3.1-PAL、pcDNA3.1-Pi IE、pc DNA3.1-FlaA和pc DNA3.1-PAL/Pi IE/FlaA表达产物,证实真核表达重组质粒pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-Pi IE、pc DNA3.1-FlaA和pc DNA3.1-PAL/Pi IE/FlaA体外转染293细胞后获得有效的表达。2、雌性BALB/c小鼠随机分为5组,分别给予重组质粒pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-PilE、pc DNA3.1-FlaA、pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA及空载质粒pc DNA3.1（+）免疫3次,最后一次增强免疫注射1,3,5,7周后,ELISA法检测血清样本中的Ig G抗体滴度。MTT法检测小鼠脾细胞的CTL杀伤活性。3、雌性BALB/c小鼠随机分为3组,分别给予重组质粒pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA、空载质粒pc DNA3.1（+）和PBS免疫3次,最后一次增强免疫2周后,小鼠腹腔内静脉注射致死剂量的LP1（2×107CFU in PBS）,LP注射16h后,每组取10只小鼠观察小鼠存活率连续10天,第11天取存活小鼠处死,取肺组织HE染色,观察小鼠肺组织病理改变;ELISA法检测血清样本TNF-α,IFNγ和IL-10水平,脾细胞分离后（分别于12h,24h,48h,72h）取上清检测TNF-α,IFNγ,IL-12,IL-4和IL-10水平。结果:1、由于军团菌生长缓慢,培养第4日出现表面光滑、呈灰白、灰蓝、紫色者,为可疑菌落,从平皿中挑取可疑菌落,分别接种在BCYE和血平板上,在BCYE平板生长而在血平板不生长的菌落为军团菌;用pc DNA3.1-FlaA,pc DNA3.1-PilE,pc DNA3.1-PAL,pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA和pc DNA3.1（+）转染293细胞72h,然后使用兔嗜肺军团菌多克隆抗体对细胞进行Western-blotting免疫印迹分析。p-PilE重组质粒表达出相对分子量约15k Da的蛋白条带;p-PAL重组质粒表达出相对分子量约19k Da的蛋白条带;p-FlaA重组质粒表达出相对分子量约34k Da的蛋白条带;p-PAL/PilE/FlaA重组质粒表达出相对分子量约70k Da的蛋白条带;空载质粒pc DNA3.1（+）转染的293细胞蛋白样品未检测到阳性杂交信号。2、最后一次增强免疫注射后的第1,3,5,7周,每次取3只小鼠采血,ELISA法检测血清样本中的Ig G抗体。结果示pc DNA3.1（+）空载质粒组没有产生抗体,Ig G抗体滴度从最后一次增强免疫后第1周开始至第5周明显升高,Ig G抗体滴度从第5周到第7周明显下降。在最后一次增强免疫后第1,3,5,7周,pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-PilE、pc DNA3.1-FlaA、pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组产生的Ig G抗体均明显高于pc DNA3.1（+）空载质粒组,差异有显著性（P<0.01）。pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组诱导机体产生Ig G抗体的效价明显高于pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-PilE、pc DNA3.1-FlaA重组质粒组,差异有显著性（P<0.05）;采用MTT增殖实验检测CTL杀伤活性,将重组质粒pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-PilE、pc DNA3.1-FlaA、pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA转染,筛选出的阳性细胞克隆作为靶细胞,用酶标仪测量570nm波长处的OD值,依据公式计算CTL的杀伤活性。pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-PilE、pc DNA3.1-FlaA、pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组产生的CTL杀伤活性均明显高于pc DNA3.1（+）空载质粒组,差异有显著性（P<0.01）。pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组产生的CTL杀伤活性明显高于pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-PilE、pc DNA3.1-FlaA重组质粒组,差异有显著性（P<0.05）。3、最后一次增强免疫后,实验小鼠分为三组,分别为PBS对照组、pc DNA3.1（+）空载质粒组、pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组。小鼠静脉内注射致死剂量的LP（2×107CFU）。每组10只小鼠监测10天,观察存活率,做生存分析。结果显示pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组小鼠的存活率100%,而PBS对照组、pc DNA3.1（+）空载质粒组小鼠的存活率为0%;小鼠静脉内注射致死剂量的LP（2×107CFU）16小时后,每组采集5只小鼠的血清,与pc DNA3.1（+）组相比,pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组血清TNF-α,IFNγ和IL-10的水平明显升高,差异有显著性（P<0.01）;在致死剂量的LP感染的小鼠脾细胞培养上清中,培养12、24、48和72小时后,pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组TNF-α、IFNγ、IL-12、IL-4和IL-10的水平明显增高,与pc DNA3.1（+）组相比,差异有显著性（P<0.01）;分离小鼠肺组织,然后经过固定、脱水、包埋、切片的步骤后,进行HE染色,在200×显微镜视野下观察小鼠肺组织形态学改变。镜下显示:1)PBS对照组:大量纤维素性渗出,上皮细胞增生明显,肺间质增宽,水肿明显。2)pc DNA3.1（+）空载质粒组:同PBS对照组相似,大量纤维素性渗出,上皮细胞明显增生,肺间质增宽,明显水肿。3)pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组:少量纤维素性渗出,上皮细胞增生不明显,肺组织轻度水肿等病理改变。肺损伤评分:肺泡水肿、出血和炎性浸润的评分为1-3（0:无,1:轻,2:中级:3:严重）,最高分为9分。结果表明PBS对照组和pc DNA3.1（+）空载质粒组肺损伤评分明显高于pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组。结论:1、以嗜肺军团菌LP1型基因组DNA为模板,PCR扩增后得PAL、PilE、FlaA、PAL/PilE/FlaA基因;成功构建了嗜肺军团菌PAL、Pi IE、FlaA基因真核表达重组质粒pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-Pi IE、pc DNA3.1-FlaA,以及PAL/Pi IE/FlaA融合基因真核表达重组质粒pc DNA3.1-PAL/Pi IE/FlaA;将真核表达重组质粒pc DNA3.1-PAL、pc DNA3.1-Pi IE、pc DNA3.1-FlaA和pc DNA3.1-PAL/Pi IE/FlaA体外转染293细胞后获得有效的表达。2、经pc DNA3.1-PAL质粒组、pc DNA3.1-PilE质粒组、pc DNA3.1-FlaA质粒组、pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组免疫的小鼠,均能诱导产生Ig G抗体,其中pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组诱导机体产生Ig G抗体的效价最高;经pc DNA3.1-PAL质粒组、pc DNA3.1-PilE质粒组、pc DNA3.1-FlaA质粒组、pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组免疫的小鼠,特异性CTL杀伤活性均高于pc DNA3.1（+）对照组;pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组的特异性CTL杀伤活性高于pc DNA3.1-PAL质粒组、pc DNA3.1-PilE质粒组、pc DNA3.1-FlaA质粒组。3、嗜肺军团菌感染小鼠后,pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组小鼠存活率明显高于pc DNA3.1（+）控载质粒组和对照组;嗜肺军团菌感染小鼠后,取存活小鼠的血标本和脾细胞做免疫检测,pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组TNF-α、IL-12、IL-4、IL-10、IFNγ的水平高于pc DNA3.1（+）空载质粒组和对照组;嗜肺军团菌感染小鼠后的肺组织病理改变显示pc DNA3.1-PAL/PilE/FlaA重组质粒组肺部损伤轻于pc DNA3.1（+）空载质粒组和对照组,表现为少量纤维素性渗出,上皮细胞增生不明显,肺组织轻度水肿。