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目的:乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤,是女性肿瘤相关死亡的主要原因。三阴性乳腺癌（ER-,PR-,Her2-,Triple negative breast cancer,TNBC）因其缺乏有效针对性的治疗靶点,是预后相对最差的乳腺癌亚型。三阴性乳腺癌因其富含乳腺癌干细胞（又名乳腺肿瘤干细胞,Breast Cancer Stem Cells,BCSCs）是高度异质性的肿瘤。乳腺肿瘤干细胞是具有自我更新特性,不断增殖以及多向分化潜能的一类数量很少的细胞亚群,也被认为是乳腺癌起源,恶性进程,治疗抵抗和早期复发转移的根源。由于目前对三阴性乳腺癌干细胞的调控机制尚未清晰阐明,揭示三阴性乳腺癌特异性的干性调控因子及机制的研究具有重要的理论和临床指导意义。HES1是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix loop helix,b HLH）类转录因子,参与许多生物学发展进程,尤其是维持干细胞未分化状态。HES1是双向转录因子,参与许多肿瘤的恶性转化,也是许多干性相关的信号通路的下游靶效应分子。在恶性肿瘤中,HES1很可能发挥调控自我更新的干细胞特性的重要作用。已发表的前期研究证实,HES1在乳腺癌中呈高表达,预示不良预后,与三阴性分型密切相关;HES1能够导致上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）,增强乳腺癌细胞迁移及侵袭能力。目前尚未见HES1在三阴性乳腺癌中的生物学属性及其对三阴性乳腺癌干细胞生物学特性调控作用的相关报道。本研究通过明确HES1对EMT驱动因子Slug的调控以及HES1/Slug轴与三阴性乳腺癌的临床相关性;阐明HES1/Slug轴在三阴性乳腺癌中调控干性的生物学功能和机制以及导致EMT,促进侵袭的功能,有望发现三阴性乳腺癌中特异性的干性调控因子及机制,为找到新的预后标志物和特异性肿瘤干细胞的个体化治疗靶点提供理论依据。研究方法:1、三阴性乳腺癌临床样本中HES1和Slug的生物学属性:在150例三阴性乳腺癌临床组织样本中,利用免疫组化检测HES1的表达情况,分析与临床病理学指标的相关性和与生存预后的相关性。在三阴性乳腺癌细胞系中,利用Western blot和RT-PCR,探究和明确HES1调控的EMT驱动因子Slug,并在150例三阴性乳腺癌临床组织样本中,利用免疫组化检测Slug的表达情况,分析Slug与临床病理学指标的相关性和利用Kaplan-Meier生存分析评估Slug与生存预后的相关性,以及利用皮尔森相关性分析评估HES1与Slug表达的相关性。2、HES1调控Slug表达的分子机制实验:利用生物信息学分析预测到Slug启动子区存在HES1潜在结合位点。利用染色质免疫共沉淀实验（Chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP）验证HES1与Slug启动子区潜在位点序列的结合关系。利用荧光素酶双报告基因实验验证HES1对Slug启动子区转录活性的调控。3、HES1通过上调Slug,促进三阴性乳腺癌干性获得的体外细胞学实验:构建稳定敲低HES1和敲低HES1后过表达Slug以及阴性对照的三阴性乳腺癌细胞系模型;通过Western blot检测SOX2,OCT4,Nanog等干性标记物的表达变化;通过干细胞球囊形成实验和克隆形成实验分别检测乳腺癌干细胞的自我更新能力和乳腺癌细胞的增殖能力的改变;通过流式细胞术检测经干细胞球囊形成实验所形成的干性球囊细胞中干性表型细胞（CD44+CD24-）亚群比例的变化。4、HES1通过上调EMT驱动因子Slug,促进三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭能力的体外细胞学实验:构建稳定敲低HES1和敲低HES1后过表达Slug以及阴性对照的三阴性乳腺癌细胞系模型;通过Western blot检测E-cadherin和N-cadherin的表达变化;通过Transwell实验检测癌细胞的迁移和侵袭能力的改变。5、HES1/Slug轴调控三阴性乳腺癌干细胞特性的体内实验:利用荷瘤鼠移植瘤实验体内验证HES1通过上调Slug对三阴性乳腺癌干性的调控。结果:1、HES1和Slug是三阴性乳腺癌的促癌预后因子:在150例临床三阴性乳腺癌组织样本中,HES1高表达与肿物大小（p=0.0262）,淋巴结转移（p=0.0129）和高TNM分期（p=0.0001）显著正相关,且预示不良预后。在三阴性乳腺癌细胞系中,HES1能够特异性的上调EMT驱动因子Slug表达。在150例临床三阴性乳腺癌组织样本中,Slug高表达与肿物大小（p=0.0092）,淋巴结转移（p=0.0060）和高TNM分期（p=0.0005）明显正相关,且预示不良预后。HES1与Slug表达呈显著的正相关性。HES1对三阴性乳腺癌生存预后的影响可能很大程度上受Slug表达情况所介导。2、HES1是Slug的转录激活因子:通过生物信息学UCSC和JASPAR网站预测HES1与Slug基因启动子区存在可能的3个结合位点,分别为BE1（5′-AAACCCAG GTGCCTA-3′）,BE2（5′-ATTTGCACGCGGCCGC-3′）,BE3（5′-AGAGCGTGGA-3′）;染色质免疫共沉淀实验（Ch IP）证实HES1能够与Slug基因启动子区BE1和BE3位点序列相结合。荧光素酶双报告基因验证Slug启动子区的BE1和BE3是转录因子HES1调控Slug启动子转录活性的必需位点序列片段。3、HES1通过上调Slug,促进三阴性乳腺癌干性获得:在三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和HCC-1937）中,敲低HES1后,干性标志物（SOX2,OCT4和Nanog）表达下调,干细胞自我更新特性降低,癌细胞增殖能力减弱,CD44+CD24-干性表型细胞亚群比例减少,而再过表达Slug后,干性标志物（SOX2,OCT4和Nanog）表达出现回升,干细胞自我更新特性和癌细胞增殖能力恢复,CD44+CD24-干性表型细胞亚群比例也上调恢复。4、HES1通过上调EMT驱动因子Slug,增强三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭能力:在三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和HCC-1937）中,敲低HES1后,E-cadherin表达上调,同时N-cadherin表达下调,癌细胞迁移和侵袭能力均减弱,而再过表达Slug后,E-cadherin表达回降,同时N-cadherin表达回升,癌细胞迁移和侵袭能力得以恢复。5、动物模型实验体内验证HES1/Slug轴调控三阴性乳腺癌干细胞特性的功能和机制:在裸鼠体内梯度成瘤模型中,与对照组（sh-NC）相比,沉默HES1（sh-HES1）组的三阴性乳腺癌干性球囊细胞（1×103和1×104个/每只鼠）的成瘤能力明显降低,而再过表达Slug后（sh-HES1+oe-Slug）的三阴性乳腺癌干性球囊细胞成瘤能力（1×103和1×104个/每只鼠）明显得到恢复;与对照组（sh-NC）相比,沉默HES1（sh-HES1）组三阴性乳腺癌干性球囊细胞（1×105个/每只鼠）成瘤大小明显受到抑制,而再过表达Slug后（sh-HES1+oe-Slug）的三阴性乳腺癌干性球囊细胞（1×105个/每只鼠）成瘤能力得到恢复。结论:1、三阴性乳腺癌中HES1和Slug是特异性高表达的促癌预后因子。2、三阴性乳腺癌中HES1可作为Slug新的转录激活因子,与Slug启动子区结合,促进Slug转录表达。3、三阴性乳腺癌中HES1通过上调Slug表达,促进自我更新的干细胞特性获得。4、三阴性乳腺癌中HES1特异性上调EMT驱动因子Slug,增强癌细胞迁移侵袭能力。由此在三阴性乳腺癌中,构成了HES1/Slug轴调控干性的模式,此信号轴为揭示三阴性乳腺癌特异性干性调控机制提供新的理论依据。