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研究背景与目的:多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）是最常见的血液系统恶性肿瘤之一,通常以骨髓中浆细胞恶性克隆增生为特征。近年来,以骨痛为首发症状的MM患者越来越多,MM溶骨性破坏引起的病理性骨折等骨相关疾病引起了骨科学界的关注。MM骨髓微环境中的成骨-破骨偶联失衡,是MM骨破坏的主要原因。DKK1是一种分泌型蛋白,能与细胞膜上Wnt受体LRP5结合,抑制成骨分化相关的Wnt/β-catenin信号通路。miRNA是一类小分子非编码RNA,能够调控包括增殖、凋亡在内的多种生物学过程。前期研究基础发现,miR-302b在MM患者骨髓样本表达水平显著低于对照组。本研究将通过在细胞和分子层面探索miR-302b与DKK1在MM骨髓微环境成骨分化过程中发挥的具体调控作用;在动物实验中探索miR-302b、DKK1与MM骨破坏之间的相关性,为临床上MM骨破坏的治疗策略提供新思路。研究方法:1、运用RT-PCR检测miR-302b在MM细胞系以及MM骨髓样本中的表达,并与对照组对比。2、体外培养MM细胞系RPMI-8226与MM1.S,并将miR-302b的模拟物、抑制物和对照组序列转染进细胞系中,RT-PCR检测转染后各组细胞miR-302b的表达。3、应用MTT法检测转染后各组细胞增殖能力的变化,Western Blot和流式细胞术检测各组细胞凋亡变化。4、运用Targetscan预测miR-302b的靶基因,并用双荧光素酶报告基因实验验证。5、运用Western Blot检测转染后各组MM细胞内DKK1的表达水平。6、将miR-302b合成物与DKK1质粒共转染进MM细胞系,检测各转染实验组MM细胞内DKK1的表达水平。7、将miR-302b合成物转染进入MM细胞中,并将转染后的MM细胞与成骨细胞前体细胞MC3T3-E1共培养,将共培养后的MC3T3-E1细胞诱导成骨分化。利用ELISA实验检测各组MC3T3-E1细胞上层培养液中DKK1的分泌水平,运用RT-PCR检测各组MC3T3-E1细胞中Collagen I表达水平,茜素红染色检测各组成骨分化的差异。8、将miR-302b合成物与DKK1质粒共转染进MM细胞系,并将转染后的各组MM细胞注射入小鼠股骨内,建立多发性骨髓瘤骨破坏的小鼠模型。利用Micro CT检测各组小鼠骨质破坏的程度。9、将miR-302b合成物与DKK1质粒共转染进MM细胞系,并将转染后的MM细胞与MC3T3-E1细胞共培养。检测共培养后各组MC3T3-E1细胞内Wnt3a、GSK3、LRP6等蛋白表达。结果:1、RT-PCR检测检测结果表明,与对照组相比,miR-302b在MM细胞系（RPMI-8226、MM1.S和U266）以及MM骨髓样本中的表达均显著下降。2、RT-PCR结果显示,经miR-302b mimic转染后,RPMI-8226和MM1.S细胞中的miR-302b表达均显著高于mimic-NC;经miR-302b inhibitor转染后,两个MM细胞株中的miR-302b表达显著低于inhibitor-NC组。3、MTT实验结果表明,与阴性对照组相比,miR-302b mimic组的MM细胞增殖能力降低;而miR-302b inhibitor组的细胞增殖能力较对照组明显增强。4、凋亡相关实验显示,与对照组相比,miR-302b上调能够促进MM细胞凋亡,升高Bax的表达水平。5、与对照组相比,MM细胞系中miR-302b mimic与野生型DKK1报告基因质粒共转染实验组的荧光素酶活性均显著下降,DKK1是miR-302b的直接靶基因。6、Western Blot结果显示,上调miR-302b能够导致MM细胞中DKK1的表达水平显著下降。此外,在miR-302b合成物与DKK1质粒共转染的MM细胞中,过表达DKK1能够降低miR-302b的抑制作用。7、在共培养实验中ELISA结果表明,与对照组相比,miR-302b过表达组的DKK1分泌水平显著下调。矿化结果显示,在共培养体系中MM细胞能够抑制MC3T3-E1细胞成骨分化能力,且miR-302b能够减轻MM细胞对MC3T3-E1细胞成骨分化能力的抑制。8、共培养后各组MC3T3-E1细胞内Wnt3a等蛋白检测结果显示,miR-302b过表达组（miR-302b mimic+DKK1 ctrl）与对照组（miR-302b mimic NC+DKK1 ctrl）相比,LRP6、Wnt3a和β-catenin的表达上调。此外,过表达MM细胞中的miR-302b能够抑制MM细胞分泌DKK1,进而减少MM细胞对MC3T3-E1细胞中的Wnt/β-catenin信号通路的抑制。9、多发性骨髓瘤骨破坏小鼠模型的Micro CT结果显示,DKK1能够促进多发性骨髓瘤介导的骨破坏,而miR-302b能够通过抑制MM细胞的DKK1分泌水平,进而降低多发性骨髓瘤的骨破坏程度。结论:1、miR-302b在多发性骨髓瘤中低表达,上调miR-302b能够抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖,并促进其凋亡。2、过表达MM细胞中的miR-302b表达水平,能够减轻MM细胞对MC3T3-E1细胞成骨分化能力的抑制。3、miR-302b通过抑制MM细胞中DKK1的分泌,减轻NOD/SCID小鼠多发性骨髓瘤诱导的骨破坏程度。