外源添加物调控红发夫酵母合成虾青素的机制研究

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虾青素是自然界中最强抗氧化剂之一,具有多种生物学功能,被广泛的应用于食品、水产养殖、营养保健品及药品等领域。红发夫酵母以其易于高密度培养的优点被选作天然虾青素生产极具潜力的微生物。然而,由于红发夫酵母虾青素发酵产量低导致价格较高而限制其广泛应用。分析原因主要是红发夫酵母的发酵策略还没有很好地优化;另一方面红发夫酵母的代谢调控机理仍需解析。因此,本论文将探讨外源物添加对红发夫酵母细胞生长和虾青素积累的影响,并结合代谢组学技术、实时荧光定量PCR技术以及转录组学技术从代谢物和基因表达水平上分析其影响机制,为红发夫酵母的细胞代谢调控机制研究奠定基础。本论文首先研究了外源植物激素的添加对红发夫酵母虾青素合成的影响。结果表明,最适添加植物激素为6-苄基腺嘌呤(6-BAP),最适添加时间为24 h,最适添加浓度为0.25 mg/L;在最适条件下,细胞生物量、虾青素的最大产量和比产率分别为3.33 g/L、15.57 mg/L和4.67 mg/g DCW,较对照组分别提高了 22.0%、34.1%和24.2%。这说明在发酵过程中添加植物激素6-BAP有利于细胞生长和虾青素积累,为红发夫酵母生产虾青素的高密度生产提供了新的策略。其次,为了分析植物激素6-BAP促进虾青素积累的细胞代谢机理,本研究运用代谢组学技术和RT-qPCR分析了细胞生长过程中胞内代谢物的差异和基因表达水平的变化,发现了 39个差异显著的代谢物。这些代谢物涉及TCA循环、糖酵解途径、碳水化合物、氨基酸和脂肪酸等多个方面。代谢分析表明,6-BAP的添加促进胞内葡萄糖等营养物质(碳源和氮源等)的利用,促进糖酵解途径,抑制TCA循环,使碳代谢流更多的流向脂肪酸合成和甲羟戊酸途径,从而促进虾青素的积累。ROS分析表明,红发夫酵母细胞内抗氧化能力因6-BAP的加入而被诱导,使虾青素大量积累。另外,6-BAP的加入使与虾青素合成有关的6个基因(hmgR、idi、crtE、crtYB、crtI和crtS)均呈现不同程度的表达上调。以上结果解释了 6-BAP调控红发夫酵母细胞生长和虾青素积累的代谢机理,为红发夫酵母规模化生产虾青素奠定基础。最后,考察了在红发夫酵母生长过程中添加柠檬酸钠对细胞生长及虾青素合成的影响。实验结果表明,柠檬酸钠最适的添加时间为24 h,最适的添加浓度为3 g/L,在此条件下,细胞生物量和虾青素的最大产量分别为6.04 g/L和22.53 mg/L,分别是对照组的1.8和2.0倍,这说明在细胞生长过程中添加柠檬酸钠有利于细胞生长和虾青素积累。接着,通过代谢组学和转录组学技术,进一步分析柠檬酸钠调控红发夫酵母的代谢途径。结果表明,柠檬酸钠的添加能够使细胞摄取更多的葡萄糖并促进糖酵解;TCA循环先削弱后增强,为生命活动提供更多的能量,也为虾青素的合成提供充足的原料;蛋白质合成的抑制使更多的乙酰辅酶A、ATP和NADPH流向红发夫酵母虾青素的合成。转录组学数据分析进一步验证了代谢组学的结论,分析显示柠檬酸钠的添加能够促进糖酵解基因、细胞膜上糖摄取相关基因、甲羟戊酸关键基因的表达上调。除此之外,还影响细胞氧化应激相关基因的表达上调,这些基因是虾青素合成过程中的重要基因。综上,本论文通过添加外源物的发酵调控手段,结合代谢组学和转录组学分析,探讨了红发夫酵母合成虾青素的细胞代谢机制,为调控红发夫酵母生产虾青素提供了新的视角与策略。
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