番茄基因SlGRAS22和SlGRAS27的克隆及功能研究

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番茄是茄科内的一种重要的植物,类似的茄科植物还有茄子、马铃薯、烟草和辣椒。在所有热带和温带大陆都发现了茄科植物,这是因为其广阔的生长环境使其具有生态和形态多样性。大多数的茄科物种都被认定是有市场价值的,因为它们能够用于药品和有毒化合物的生产。由于番茄的生长周期短,转化、嫁接和栽培比较方便,所以在近十几年中,番茄主要是作为一种有价值的模式植物被用于实验室研究。番茄起源于美国的西南部,从安第斯山脉到欧洲大陆,从热带雨林到沙漠地区,再到高海拔山区都有分布。根据一个比较可信的调查,番茄是通过长期的驯化得来的一个农产品。番茄首先被西班牙人阿兹台克人(墨西哥)发现,然后是由西班牙的征服者科尔特斯,首先向西班牙引进番茄,并再由西班牙将其传播到了意大利。在经过了16世纪的驯化之后,番茄在全球范围内广泛被应用。在2014年全球番茄生产量达到了1.7亿吨,所以它是世界范围内最为重要的茄科植物之一,这也表示番茄是最经济价值的茄科蔬菜。它也是许多可食用产品如果汁、酱料、酱汁、汤和粉末等的重要组成部分。国际茄科植物基因组计划(SOL)目前开始了关于茄科基因信息网络的构建,以描述其基因和蛋白质相互作用对茄科内超过3000种植物造成的生态学和形态学范畴的差异。  转录因子作为活细胞中主要调控蛋白的基因,通常表现出特异性的 DNA结合序列和在广泛基因中具有抑制或触发转录的能力。大约7%的基因都是转录因子,而且转录因子对基因表达的调控是许多生物学机制中的关键因素。通常转录因子是由两个结构域组成,一个转录调控结构域和一个与 DNA结合的结构域,它也包含核定位信号和寡聚位点。然而在对大量的转录调节或与 DNA特异性结合结构域转录组功能进行研究发现,在果实发育和成熟过程中,参与不同代谢途径的基因表达的变化是具有多样的。此外,编码酶的大量基因转录物参与抗坏血酸的生物合成,表现出的昼夜和光影响的变化,表明也存在影响调控的外部环境因素。事实上,环境调控是影响水果营养状况的重点,另外生物合成也可能是在发育调控过程中受到多种转录因子的控制。通过研究与生物合成基因相关的转录因子可以解释影响代谢物积累的调节机制。通过研究已经鉴定出的许多与类胡萝卜素代谢调节有关的基因,比如在拟南芥中类胡萝卜素的调节已被证明是通过RAP2和PIF1调节PSY转录完成的。  在植物体中,GRAS是一个重要的转录因子家族,它主要是作为几种生长协同和环境调节信号,如腋芽的分生组织形成,植物激素,根的向性,光信号,生物和非生物胁迫。已经有几项研究证明了转录因子在高等植物中的几种生理机制和调节复合物中起着重要作用。通常,GRAS家族基因编码的蛋白质具有保守的末端 C,也被称为 GRAS结构域,其包含了几个组织和保守基序,其中包含两个富含亮氨酸的区域(LHR)I和 II,VHIID,PFYRE和 SAW。另一方面,这个结构域以不同的长度和顺序共享 N个末端,这表明它主要参与每个基因特定功能的表达。大量的 GRAS基因在不同的植物物种中被鉴定出来,如杨树中的106个,拟南芥中的34个,水稻中的的60个,番茄中的53个。根据系统发育学分析,这些基因被分为13个 GRAS蛋白亚家族。通过对整个 GRAS家族基因进行研究,只有少数基因具有特异功能。目前,番茄作为一种重要的肉质果实和模式植物通常被用来研究GRAS家族基因的主要功能。  在本研究中,我们选取SlGRAS家族中的SlGRAS22和SlGRAS27两个基因在野生番茄品种(WT)Ailsa Craig(AC++)中研究其基因功能,SlGRAS22属于Pt20 GRAS蛋白亚家族,而 SlGRAS27是 Os4 GRAS蛋白亚家族成员之一,它们在番茄数据库里的编号分别为 solyc01g079370和 solyc02g094340,编码蛋白分别为844个氨基酸和680个氨基酸。通过比较番茄各基因家族的氨基酸长度,等电点,分子量和疏水性等来对两个基因的生物信息学进行比较,然后再通过与其他番茄基因和其他物种的基因一起进行系统发育分析后,我们发现这两个基因与 sldella基因功能相似。  通过对野生型(AC++)番茄里进行所有组织基因表达模式的分析,发现SlGRAS22基因的主要表达是在果实发育阶段的未成熟期(IMG时期)和破色后4天(B+4时期)的时期,之后我们通过在另一个番茄品种 Nr(主要用于研究番茄成熟)内进行表达模式分析,发现在破色后7天的时期(B+7)和未成熟时期(IMG)中表达最高,这说明该基因在果实生长和成熟中可能具有重要作用。首先我们在萼片和花朵中检测到了 SlGRAS27基因的表达,随后我们进行了进一步的分析研究,在花的不同部位进行基因表达量分析,我们发现在花瓣中出现了大量表达,特别是花瓣和雌蕊,这说明该基因与花的维持和生长有关。随后我们进行了进一步的功能研究,设计了SlGRAS22和SlGRAS27基因的沉默引物,并通过PCR反应扩增,连接到 A尾,然后连接正向和反向,再连接到终载体pHANNIBAL上。这种连接是通过切割位点特异性核酸内切酶了,再利用大肠杆菌构建基因沉默载体。利用 RNA干扰技术构建基因沉默载体后,再利用农杆菌转化到野生型番茄的子叶上,获得转基因番茄植株。最后再将转基因番茄植株驯化到田间种植鉴定表型。根据研究发现,DELLA是番茄生长每个阶段的关键蛋白质,SlGRAS22与 RGL1相似,RGL1突变导致拟南芥果实产生异常或无果实, SlGRAS22的沉默可能导致番茄植株矮化或者果实异常。基因 SlGRAS27也类似于DELLA RGL1蛋白,通过对拟南芥突变体的研究发现,DELLA RGL1的异常会导致植株叶片深绿色和晚花或不开花,这表明 SlGRAS27的沉默可能在番茄中会对开花产生影响。
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