抑郁症（Depression）是一种常见的心境障碍类疾病,主要的临床表现为心境低落、兴趣快感缺失,睡眠及认知功能障碍,严重时甚至有明显的自杀倾向。据统计,全球抑郁症患者的总人数已超过3亿人,抑郁症将成为全球第二大疾病。目前,抑郁症的临床治疗以靶向单胺能神经递质的药物治疗为主,但常用的抗抑郁药物普遍存在起效慢、持续时间短、疗效差等问题。因此,深入阐明抑郁症的病理机制,研发基于新靶点的快速、长效抗抑郁药迫在眉睫。大量研究表明,抑郁症患者以及抑郁模型小鼠的海马脑区均出现明显的萎缩,突触数量也有不同程度的减少,突触结构和功能受到破坏,导致突触可塑性障碍。线粒体是ATP产生的主要场所,对维持神经递质的释放和突触功能稳态等具有关键作用。研究表明,抑郁症中线粒体功能障碍,可进一步加重突触可塑性损伤。线粒体分裂融合失衡在维持线粒体功能稳态方面起着至关重要的作用,线粒体分裂与融合障碍是否与抑郁症中线粒体的功能异常及突触可塑性的损伤有关,尚未见研究报道。因此,本文拟研究并阐明线粒体的分裂与融合异常改变对抑郁症脑内突触可塑性的影响及其作用机制,为研发“非单胺类”抗抑郁新药和抗抑郁治疗提供新的思路。埃他卡林（Iptakalim,Ipt）是一种新型ATP敏感性钾通道的开放剂,是我国研究人员自主设计、合成的芳香仲胺类小分子化合物。埃他卡林易透过血脑屏障,目前研究也已证实其在不扩张血管和不影响血压的剂量下,在脑卒中、帕金森病等动物模型以及细胞模型中可对抗神经元及星形胶质细胞损伤,具有显著的神经保护作用。我们前期的研究表明,埃他卡林通过减轻小鼠下丘脑的炎症和氧化应激,发挥了抗抑郁的保护作用,但其确切机制尚未明确。因此,本文工作通过制备在体（慢性轻度应激方法建立的抑郁症动物模型）和离体（皮质酮刺激引起损伤的细胞模型）抑郁症模型,研究、揭示埃他卡林抗抑郁作用的新机制,为其作为“非单胺类”抗抑郁药的开发提供实验依据。目的:研究、揭示埃他卡林对抑郁症模型小鼠突触可塑性的改善作用,阐明埃他卡林改善小鼠抑郁样行为的作用机制。方法:1.抑郁症模型小鼠的制备:应用6-7周龄C57BL/6品系雄性小鼠,随机分为正常对照组,模型组,埃他卡林给药处理组以及氟西汀给药处理组。采用慢性轻度应激（Chronic mild stress,CMS）法建立小鼠抑郁症在体模型,在造模4周后,给予埃他卡林或氟西汀药物治疗,持续4周。通过糖水偏爱实验（Sucrose preference test,SPT）、强迫游泳（Forced swimming test,FST）、悬尾实验（Tail suspension test,TST）以及旷场实验（Open field test,OFT）等行为学评价小鼠的抑郁样行为以及埃他卡林的抗抑郁作用。2.应用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察各组小鼠海马脑区神经元突触结构的改变以及线粒体的形态和结构变化。3.采用免疫荧光技术（Immunofluorescence,IF）检测各组小鼠海马脑区微管相关蛋白2（Microtubule associated protein 2,MAP2）标记的神经元突起结构改变,细胞色素c氧化酶IV（Cytochrome c oxidaseⅣ,COXⅣ）标记的线粒体形态和结构变化以及神经元突触相关蛋白突触后致密物95（Postsynaptic density 95,PSD95）、突触素（Synaptophysin,SYN）的表达变化。4.分离培养小鼠原代神经元,通过皮质酮诱导法,建立抑郁症的离体细胞模型;通过免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）染色检测MAP2标记的神经元突起结构和Mito Tracker（?）Red CMXRos标记的神经元线粒体的形态以及数量的变化。5.采用si RNA技术转染N2a细胞系,观察下调Mito K亚基对于埃他卡林发挥相关保护作用的影响。6.应用ATP检测试剂盒以及线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）,评价抑郁症的离体细胞模型中,神经元线粒体的功能变化。7.应用四甲基偶氮唑盐（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）以及乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase,LDH）检测试剂盒检测细胞活力和细胞损伤。8.应用蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测小鼠海马组织以及细胞样本中突触相关蛋白PSD95、突触素（Synaptophysin,SYN）以及线粒体分裂融合相关蛋白包括动力蛋白相关蛋白1（Dynamin-related protein 1,Drp1）、视神经萎缩1（Optic atrophy 1,OPA1）的表达情况。结果:1.埃他卡林改善抑郁症模型小鼠的抑郁样行为与正常对照组相比,抑郁症模型小鼠糖水偏爱率以及体重出现明显下降,而埃他卡林处理能够明显改善抑郁症模型小鼠糖水偏爱率以及体重的下降;与抑郁症模型组小鼠相比,埃他卡林处理组小鼠在FST、TST中的不动时间显著缩短,同时在OFT中的总的活动距离以及在中心区域自发活动的时间显著增加。研究结果表明,埃他卡林可以改善抑郁症模型小鼠的抑郁样行为。2.埃他卡林减轻抑郁症模型小鼠海马脑区突触结构可塑性的损伤埃他卡林处理可改善抑郁症模型小鼠突触后致密物厚度和突触界面曲率下降、突触间隙宽度增加等突触结构损伤;组织免疫荧光结果显示,埃他卡林可减轻抑郁症模型小鼠MAP2标记阳性的海马神经元萎缩、突起长度缩短以及密度下降;进一步研究发现,埃他卡林可部分逆转抑郁症模型小鼠海马脑区突触相关蛋白PSD95和SYN的表达下调。研究结果表明,埃他卡林可以改善抑郁症模型小鼠海马脑区神经元突触结构可塑性的破坏。3.埃他卡林改善抑郁症模型小鼠海马神经元内线粒体的结构破坏和线粒体异常分裂免疫荧光染色结果显示,埃他卡林可以改善抑郁症模型小鼠海马脑区神经元线粒体的严重碎片化;通过电镜观察发现,埃他卡林部分逆转抑郁症模型小鼠海马脑区线粒体结构的破坏及碎片化,同时可减轻线粒体动力学损伤;蛋白免疫印迹实验结果表明,埃他卡林可以抑制抑郁症模型小鼠海马线粒体分裂相关蛋白p-Drp1/Drp1的异常升高以及线粒体融合蛋白OPA1的显著降低,同时抑制Drp1由胞浆向线粒体转运,进而改善线粒体的异常分裂现象。研究结果提示,埃他卡林通过减轻抑郁症模型小鼠海马线粒体的结构破坏和线粒体过度分裂,改善线粒体的功能异常。4.埃他卡林逆转皮质酮诱导的小鼠原代神经元的突起和突触结构的破坏应用细胞免疫荧光化学染色观察MAP2阳性标记的神经元树突结构的改变,结果显示,埃他卡林可逆转皮质酮诱导神经元突起的分支长度和分支数目的明显下降,且呈现浓度依赖性。蛋白免疫印迹结果表明,埃他卡林可部分逆转皮质酮诱导神经元的突触相关蛋白PSD95以及SYN的表达下调。提示埃他卡林呈浓度依赖性改善皮质酮诱导神经元的突起和突触结构的破坏。5.埃他卡林改善皮质酮所致小鼠原代神经元线粒体异常分裂和线粒体功能障碍应用激光共聚焦显微镜观察Mito Tracker Red探针标记的线粒体,研究结果显示,埃他卡林可改善皮质酮诱导小鼠神经元线粒体的碎片化程度增加以及网状结构的破坏;蛋白免疫印迹结果显示,埃他卡林可部分逆转皮质酮诱导的线粒体分裂蛋白p-Drp1/Drp1升高、线粒体融合蛋白OPA1表达下调。同时,通过对于神经元中ATP的含量以及线粒体膜电位的检测,发现埃他卡林可浓度依赖性地增加神经元线粒体ATP的含量以及线粒体膜电位。6.埃他卡林改善线粒体结构和功能的作用依赖于线粒体ATP敏感性钾通道通过MTT法检测细胞活力的改变,结果显示皮质酮（100μM）引起N2a细胞活力下降,而埃他卡林（100μM）处理显著减轻皮质酮引起的细胞活力的下降。采用si RNA干扰下调线粒体ATP敏感性钾通道亚基Mito K的表达,应用激光共聚焦显微镜观察的结果显示,下调Mito K亚基的表达能部分取消埃他卡林改善皮质酮诱导细胞线粒体结构破坏的作用;蛋白免疫印迹结果也显示,Mito K亚基的表达下调能部分取消埃他卡林逆转线粒体分裂蛋白p-Drp1/Drp1增加和线粒体融合蛋白OPA1表达下降的作用;同样,部分取消了埃他卡林促进细胞ATP的产生以及提高线粒体膜电位的保护作用。研究表明,埃他卡林通过作用于线粒体ATP敏感性钾通道改善皮质酮诱导的神经元线粒体结构和功能的异常。7.埃他卡林作用于线粒体ATP敏感性钾通道改善皮质酮所致神经元突触可塑性异常研究发现,埃他卡林可以抑制皮质酮诱导的突触相关蛋白PSD95和SYN表达下调,而该作用在Mito K亚基表达下调后被部分取消。同样,下调Mito K亚基后,埃他卡林抑制皮质酮诱导细胞释放LDH的作用被部分取消。结果提示埃他卡林通过作用于线粒体ATP敏感性钾通道对皮质酮诱导的神经元突触结构可塑性异常发挥保护作用。结论:埃他卡林通过作用于线粒体ATP敏感性钾通道,改善线粒体分裂异常、线粒体结构损伤、膜电位以及ATP产生下降,从而改善突触功能、发挥抗抑郁作用。本文工作的创新之处:1.阐明埃他卡林改善抑郁症模型小鼠抑郁样行为的新机制。埃他卡林通过调节线粒体分裂融合,改善线粒体的结构和功能,进而改善突触功能、发挥抗抑郁作用;2.揭示线粒体ATP敏感性钾通道在埃他卡林调节线粒体结构和功能稳态以及突触可塑性中的重要作用,为“非单胺类”抗抑郁药物的研发提供新靶标。