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目前抑郁症已成为世界上发病率第一的精神类疾病。其临床症状在于情绪状态不佳、思维反应迟钝、兴趣快感丧失、意志活动减退、自残以及自杀等[1]。由于抑郁症的高患病率、复发率及自杀死亡率,使其成为了社会和家庭沉重的负担[2]。抑郁症的病理特征主要是:皮层和海马萎缩,神经元轴突缩短,海马脑区神经再生障碍,以及胶质细胞数目的变化[3][4]。目前抑郁症发病机制学说主要包括四个方面:1.神经可塑性假说;2.兴奋性毒性假说;3.单胺假说;4.免疫炎症假说[5]。虽然关于抑郁症的研究已有很多,但是很多研究仍旧停留在现象学上的关联。因此本课题拟进一步探究抑郁症发生发展的作用机制,探寻新的作用靶点。G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors,GPCRs）在各种生理和病理过程中都发挥重要作用,并且大量的临床药物以其作为靶点来发挥治疗作用[6]。β-抑制蛋白（β-arrestins）是一类能与G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinase,GRK）结合,使受体脱敏并参与细胞信号转导的级联反应的GPCR的负性调控因子[7]。目前已发现arrestin蛋白家族主要分为两类:一类蛋白主要分布于视觉系统;另一类是在各组织中广泛分布的β-arrestins[8][9]。本课题研究的是β-arrestin1,是β-arrestins中的一员,结构上与β-arrestin2有78%的同源性,能够影响肺癌,糖尿病等疾病的病理过程。已有相文献报道,抑郁症患者单核白细胞中β-arrestin1蛋白和m RNA水平与健康人相比出现明显降低,抗抑郁药治疗后可将其改善[10]。并且β-arrestin1可能是抗抑郁作用的重要靶点,抗抑郁药以依赖于β-arrestin1方式使胶质细胞释放胶质细胞源性神经营养因子增多,从而促进神经发生和神经元可塑性[11]。与此同时,在15年一项研究中,检测月经黄体期的非妊娠妇女外周血单核细胞中β-arrestin1蛋白水平,并与汉密尔顿抑郁评定量表得分进行了比较,汉密尔顿抑郁的分数越高,人体外周血中单核白细胞中β-arrestin1蛋白表达越少,抑郁症状况越严重[12]。这些研究表明了,通过评估β-arrestin1的水平可以在一定程度上反应抑郁症严重程度。然而β-arrestin1对抑郁症影响的具体作用和机制还不清楚,因此论文拟在基础研究中探究β-arrestin1在对抑郁症发生发展的作用及其机制。目的:探究β-arrestin1与抑郁症的相关性及其对细胞的机制;探究β-arrestin1调节小胶质细胞NLRP3炎症小体激活的作用机制;方法:在WT小鼠中造CMS抑郁症模型,用western blotting检测CMS小鼠海马脑区β-arrestin1蛋白表达情况;并且通过免疫荧光实验观察β-arrestin1在CMS小鼠海马神经胶质细胞和神经元中的表达情况。在WT及β-arrestin1敲除(β-arrestin1-/-)小鼠中造CMS抑郁症模型,检测抑郁症相关病理变化:1.行为学检测:蔗糖偏好实验、新奇摄食实验、强迫游泳试验、悬尾实验,旷场,评价β-arrestin1对CMS小鼠的抑郁样行为的影响;2.高效液相色谱法检测β-arrestin1对CMS小鼠海马单胺类神经递质以及氨基酸类神经递质的影响;3.免疫荧光实验检测β-arrestin1对CMS小鼠海马脑区神经元胞核Neu N阳性细胞数量以及突触形态指标MAP2,突触密度指标SYP荧光强度的影响;4.高尔基实验分析统计β-arrestin1对CMS小鼠神经元树突个数和树突棘密度的影响;5.RT-PCR和ELISA实验检测β-arrestin1对CMS小鼠海马组织和外周血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达和释放的影响;6.应用免疫荧光观察β-arrestin1对CMS小鼠星形胶质细胞丢失的影响;7.应用免疫组化观察β-arrestin1对CMS小鼠小胶质细胞活化的影响;8.提取小鼠海马蛋白,进行western blotting实验,检测NOD样受体热蛋白结构域3（NOD-like receptors,NLRP3）、胱冬肽酶-1前体（Precursor-cysteinyl aspartate specific proteinase,pro-caspase1）、胱冬肽酶-1（Cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase1）以及白介素-1β前体（Precursor-Interleukin 1 betta,pro-IL-1β）和白介素-1β（Interleukin 1 betta,IL-1β）的蛋白水平,探究β-arrestin1对抑郁症中NLRP3炎症小体激活的影响。培养WT及β-arrestin1-/-小鼠原代小胶质细胞,用LPS+ATP刺激后;1.检测细胞NLRP3、pro-caspase1和pro-IL-1β蛋白水平和细胞上清中caspase1以及IL-1β蛋白水平;2.RT-PCR实验检测小鼠原代小胶质细胞中NLRP3 m RNA的表达水平;3.CO-IP实验进一步探究β-arrestin1敲除对原代小胶质细胞NLRP3炎症小体的泛素化（ubiquitination,UB）的影响。接着培养WT原代小胶质细胞给予LPS+ATP刺激后,用CO-IP和免疫荧光共标检测NLRP3和β-arrestin1是否发生蛋白互作。结果:1.β-arrestin1对CMS小鼠行为学和病理特征的影响与对照组相比,在CMS抑郁症模型小鼠中,海马组织中β-arrestin1蛋白水平显著升高。脑片荧光结果与western blotting结果一致,在小鼠海马DG区中β-arrestin1表达上调,且主要表达在小胶质细胞上,表明β-arrestin1可能与抑郁症是具有相关性的。接着运用WT和β-arrestin1敲除鼠制备CMS模型并检测其行为学,结果发现β-arrestin1敲除后可以改善CMS小鼠抑郁样行为,包括悬尾和强迫游泳实验中不动性的增加、蔗糖偏好率的下降以及体重的增长减少等。高效液相实验也表明β-arrestin1敲除可缓解CMS小鼠海马内部分单胺类神经递质水平异常,而对氨基酸类神经递质水平影响较小。应用免疫荧光检测神经元胞核Neu N阳性细胞数目、突触形态指标MAP2以及突触密度指标SYP的荧光强度,发现β-arrestin1敲除能缓解神经元形态损伤,但不影响神经元胞核的数量。应用高尔基染色进一步佐证,β-arrestin1敲除能缓解了CMS模型制备后神经元树突个数和树突棘密度的下调,并且β-arrestin1敲除后还能缓解CMS小鼠海马星形胶质细胞丢失的情况。表明了β-arrestin1能够参与CMS小鼠的病理过程。2.β-arrestin1对CMS小鼠中炎症反应和NLRP3激活的作用和初步的机制探讨由于β-arrestin1主要在小胶质细胞上表达,且炎症反应是抑郁症发生发展的重要机制之一。因此我们通过免疫组化实验来检测CMS小鼠海马区小胶质细胞标记物IBA-1,实验结果表明了β-arrestin1敲除后抑制了CMS造模后小胶质细胞数量的增多和胞体的增大;RT-PCR和ELISA实验结果显示,β-arrestin1敲除后可以缓解CMS小鼠海马和血清中IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子表达的上调,并且β-arrestin1敲除还能抑制CMS小鼠海马组织NLRP3炎症小体、IL-1β和caspase1表达的上调。在细胞水平上,敲除β-arrestin1后也可抑制应激后原代小胶质细胞中NLRP3的表达、上清中成熟caspase1和IL-1β分泌,表明了敲除β-arrestin1能够抑制NLRP3炎症小体的激活。接着进行机制研究,通过RT-PCR检测,我们发现β-arrestin1敲除不影响LPS+ATP诱导的小胶质细胞NLRP3 m RNA水平的上调,因此说明β-arrestin1可能不影响NLRP3的合成,推测其可能影响NLRP3炎症小体的降解。因此运用CO-IP检测UB与NLRP3结合情况并发现LPS+ATP刺激后促进小胶质细胞的NLRP3炎症小体泛素化,β-arrestin1敲除能够进一步提高泛素化,从而促进NLRP3的降解。并且CO-IP实验发现给予LPS+ATP刺激后,β-arrestin1和NLRP3结合增多;同时免疫荧光也发现在LPS+ATP刺激下,小胶质细胞中β-arrestin1与NLRP3共定位增多。说明β-arrestin1可以通过与NLRP3结合抑制NLRP3泛素化和降解。结论:1.β-arrestin1和抑郁症具有相关性,敲除β-arrestin1能改善CMS小鼠行为学和病理特征。2.β-arrestin1参与抑郁症中炎症反应及小胶质细胞NLRP3的激活,其机制可能是β-arrestin1能与NLRP3发生蛋白互作抑制NLRP3泛素化从而影响其降解。综上所述,本文创新之处:1.发现β-arrestin1在抑郁症中表达上调且介导抑郁样行为和病理变化,参与调节CMS模型下小鼠的神经炎症,深化了对抑郁症病理生理机制的认识。2.揭示β-arrestin1能够调节抑郁症中NLRP3炎症小体的激活并初步阐明β-arrestin1能够抑制NLRP3炎症小体降解来调节其激活。为针对β-arrestin1为靶点治疗抑郁症提供了新的思路。