【摘 要】
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目的分析膀胱癌和癌旁组织中差异表达的微小RNAs（micro RNAs,miRNAs）的差异性表达情况,选取其中差异性表达最为明显的miR-181c-5p作为研究对象,分析miR-181c-5p在膀胱癌细胞中的生物学功能,并探讨miR-181c-5p可能结合的靶点,为膀胱癌的早期诊断和后期治疗提供新的可能性依据。方法收集膀胱癌患者的膀胱癌组织和临近组织标本,通过miRNA芯片筛查出其中差异性表达的
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目的分析膀胱癌和癌旁组织中差异表达的微小RNAs（micro RNAs,miRNAs）的差异性表达情况,选取其中差异性表达最为明显的miR-181c-5p作为研究对象,分析miR-181c-5p在膀胱癌细胞中的生物学功能,并探讨miR-181c-5p可能结合的靶点,为膀胱癌的早期诊断和后期治疗提供新的可能性依据。方法收集膀胱癌患者的膀胱癌组织和临近组织标本,通过miRNA芯片筛查出其中差异性表达的miRNAs,选取最为明显的miR-181c-5p作为后续研究。采用实时荧光定量PCR分析评估50例患者的膀胱癌组织和癌旁组织标本中miR-181c-5p的表达情况。通过实时荧光定量PCR检测miR-181c-5p在膀胱细胞系T24和UMUC3及人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1中表达水平。选取2株膀胱癌细胞T24和UMUC3作为研究对象,miR-181c-5p模拟物和抑制剂分别转染T24和UMUC3细胞,实时荧光定量PCR检测miR-181c-5p表达,以验证转染效率。通过MTT实验检测膀胱癌细胞系的增殖情况;通过Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;通过流式细胞术来检测细胞凋亡水平。将T24细胞皮下注射裸鼠并给于agomiR-181c-5p及antagomiR-181c-5p,测量肿瘤体积及瘤重,并通过免疫荧光检测肿瘤Ki-67表达,通过TUNEL实验检测肿瘤细胞凋亡。通过生物信息学分析miR-181c-5p可能结合靶基因并通过Cytoscape分析其中的枢纽基因AKT3,并利用双荧光素酶报告基因实验进行验证。利用实时定量PCR分析膀胱癌组织和癌旁组织中AKT3 m RNA表达,并通过皮尔森相关性分析检测膀胱癌组织中miR-181c-5p和AKT3 m RNA表达相关性。通过Western blot检测AKT3蛋白表达在膀胱癌组织和癌旁组织中。在转染miR-181c-5p模拟物的基础上转染AKT过表达质粒或在转染miR-181c-5p抑制剂的基础上转染AKT si RNA,通过MTT实验检测膀胱癌细胞系的增殖情况;通过Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;细胞凋亡水通过流式细胞术来检测。结果hsa-miR-651-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-124-3p等miRNAs在膀胱癌组织中上调,hsa-miR-195-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-128-3p、hsa-miR-320e、hsa-miR-212-5p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-155-5p等miRNAs在膀胱癌组织中下调,其中miR-181c-5p下调最为显著。上调miR-181c-5p从而抑制膀胱癌细胞增殖、迁移及移植瘤肿瘤生长,最终使得细胞出现凋亡,反之,下调miR-181c-5p表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移及移植瘤肿瘤生长并抑制细胞凋亡。MiR-181c-5p与79个基因存在潜在结合位点,且AKT3为其中的枢纽基因。AKT m RNA在膀胱癌组织中高表达且其表达与miR-181c-5p表达呈负相关。上调miR-181c-5p抑制AKT3表达,下调miR-181c-5p促进AKT3表达。过表达AKT3逆转了上调miR-181c-5p对膀胱癌细胞增殖和迁移的抑制作用及凋亡的促进作用;沉默AKT3逆转了下调miR-181c-5p对膀胱癌细胞增殖和迁移的促进作用及凋亡的抑制作用。结论1、多种miRNAs在膀胱癌组织中存在差异性表达,其中miR-181c-5p下调最为显著。2、在miR-181c-5p体外抑制膀胱癌细胞增殖和迁移并促进细胞凋亡,且在体内抑制膀胱癌细胞移植瘤肿瘤生长。3、通过miR-181c-5p靶向抑制AKT3表达调节膀胱癌进展。
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