论文部分内容阅读
目的胶质瘤是人类中枢神经系统最常见和最恶性的肿瘤。其高度转移性和浸润性给临床治疗带来重大挑战。过往手术结合放疗和化疗的治疗方案效果不好,病人生存率低。因此,深入探究胶质瘤发生、发展的分子机制,通过其生物标志物和靶点尽早进行诊断与干预,成为胶质瘤研究的又一热点。CDX2基因是一种特异性的核转录因子,既往研究报道其以多种方式参与肿瘤的发生和发展。但CDX2在不同肿瘤中的作用不尽相同,在部分肿瘤中发挥出抑癌基因的特性,也在一些肿瘤中发挥原癌基因的作用。CDX2与胶质瘤的相关性作用报道较少见,但可以肯定的是CDX2参与了胶质瘤细胞EMT的调控。本研究中,我们应用生物信息学、细胞生物学和分子生物学的方法,设计并开展了一系列体外功能学实验。旨在验证CDX2基因表达对胶质瘤生物学行为的影响,探究CDX2基因参与胶质瘤细胞侵袭和转移的分子机制。为胶质瘤的临床治疗提供新的思路。方法应用免疫组化法检测胶质瘤及癌旁正常组织中CDX2基因的表达;应用Western-Blot法检测瘤及癌旁正常组织中CDX2基因的表达;应用si RNA转染的方法特异性敲减U-87 MG细胞CDX2基因的表达;应用CCK-8法检测敲减CDX2前后U-87 MG细胞活力的改变;应用平板克隆形成实验检测敲减CDX2前后U-87 MG细胞增殖能力的改变;应用流式细胞仪检测U-87 MG细胞细胞周期和细胞凋亡水平的改变;应用Transwell法检测CDX2敲减前后U-87 MG细胞侵袭能力的改变;应用Western-Blot法检测CDX2敲减前后细胞周期相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白、细胞侵袭相关蛋白和细胞EMT相关蛋白的表达改变。应用Star Base数据库预测CDX2基因下游靶基因的候选;应用q PCR法检测敲减CDX2前后U-87 MG细胞下游靶基因表达的改变;应用Western-Blot法检测敲减CDX2前后U-87 MG细胞下游靶基因及信号通路相关蛋白的表达改变;应用sh RNA转染嘌呤霉素筛选的方法构建CDX2稳转U-87 MG细胞株;应用si RNA转染的方法在CDX2-KD的基础上敲减下游靶基因RASSF1A;Transwell实验验证CDX2-KD的基础上敲减下游靶基因RASSF1A对细胞侵袭能力的回复作用;Western-Blot法验证CDX2-KD的基础上敲减下游靶基因RASSF1A对细胞侵袭相关蛋白和细胞EMT相关蛋白表达的回复作用。结果胶质瘤患者组织样本中,癌中CDX2蛋白表达明显高于癌旁正常组织,差异有统计学意义（P＜0.05）;敲减CDX2基因表达抑制U-87 MG细胞的细胞活力,差异有统计学意义（P＜0.05）;敲减CDX2基因表达引起U-87 MG细胞在G0/G1期的比例增多,影响了细胞增殖,差异有统计学意义（P＜0.05）;敲减CDX2基因表达对U-87MG细胞凋亡水平无影响,差异无统计学意义（P＞0.05）;敲减CDX2基因抑制U-87 MG细胞侵袭能力,差异有统计学意义（P＜0.05）;敲减CDX2基因抑制U-87 MG细胞的细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6和Cyclin D1的表达水平,差异有统计学意义（P＜0.05）;敲减CDX2基因对U-87 MG细胞凋亡相关标志蛋白Bcl2、Bax和Caspase3表达水平未见明显影响,差异无统计学意义（P＞0.05）;敲减CDX2基因使U-87 MG细胞侵袭相关的MMP2、MMP9蛋白表达受到抑制,而促进了TIMP2蛋白表达水平,差异有统计学意义（P＜0.05）;在细胞EMT相关蛋白中,敲减CDX2基因促进ECAD蛋白表达水平,抑制NCAD、Vimentin蛋白表达水平,差异有统计学意义（P＜0.05）;敲减CDX2基因后U-87 MG细胞下游候选基因中,DVL1表达明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;EXOC4基因表达水平不变,差异无统计学意义（P＞0.05）;HOXB3基因表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;MAP4K4基因表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;敲减CDX2基因后U-87 MG细胞下游CDX2蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;HOXB3蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;Dnmt3B蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;RASSF1A蛋白表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;在CDX2-KD的基础上敲减下游靶基因RASSF1A后能部分逆转CDX2-KD引起的U-87 MG细胞侵袭能力减弱,差异有统计学意义（P＜0.05）;在CDX2-KD的基础上敲减下游靶基因RASSF1A后能部分逆转CDX2-KD引起的U-87 MG细胞EMT减弱,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论一、胶质瘤患者中,癌组织CDX2基因的表达水平显著高于癌旁正常组织。二、胶质瘤细胞系中,敲减CDX2基因通过引起G0/G1期细胞周期阻滞的方式抑制肿瘤细胞增殖。三、胶质瘤细胞系中,敲减CDX2基因通过抑制EMT的方式抑制肿瘤细胞侵袭和转移。四、胶质瘤细胞系中,CDX2基因通过HOXB3/Dnmt3B/RASSF1A轴促进EMT的方式促进肿瘤细胞的侵袭和转移。