苹果酸广泛存在于植物、动物以及微生物之中,是在多种生命体代谢反应过程中产生的一种重要的中间代谢产物。因其容易在体内代谢,且具有较好的防腐杀菌作用和特别的香味,苹果酸被广泛地应用于食品、药品和日化用品等的添加剂和防腐剂。因为对苹果酸的广泛需求,针对苹果酸生产的研究也较多。目前,苹果酸的生产方法已由早期单一的提取法发展和细分成化学合成法、生物发酵法、酶催化法等多种方法。化学法合成苹果酸的优点是条件简单可控,速度快,但也有明显的缺点,比如消耗能量较多,分离纯化难度较大。苹果酸的微生物发酵法是将本来可以生产苹果酸的酵母菌、曲霉等微生物进行诱变,然后筛选高产的菌株,并通过发酵糖类等物质生产苹果酸。或使用以产生苹果酸为主的特殊菌类进行发酵,可获苹果酸产品。目前部分的方法已实现了工业化生产,针对其的研究和优化也越来越多。乳酸杆菌都具有乳酸这一代谢产物,改变乳酸杆菌的代谢通路,使乳酸杆菌原用于生产乳酸的代谢原料丙酮酸在改造苹果酸酶的作用下可以生产苹果酸。并且一般乳酸杆菌的代谢物富含酸性物质,可以利用这一特点在发酵原料液中添加可以与弱酸性物质反应的碳酸盐,如此,通过碳酸盐和代谢酸性物质相互反应,不仅可以为苹果酸酶提供二氧化碳作为反应底物,又能有效地缓解发酵液内不断积累的酸性物质,使菌体的生长得到了保证。本文的工作是在目前最新的有关苹果酸发酵代谢途径的研究基础上,通过基因工程方法进行苹果酸有关合成酶基因的定点突变,以达到优化生产的目的。提取大肠杆菌K-12(Escherichia coli K-12)基因组,通过聚合酶链式反应扩增目的片段,结合重叠PCR对其进行定点突变,使苹果酸酶的104位酪氨酸突变为谷氨酰胺,获得突变后的苹果酸酶(SM-NAD-Y104Q)。经限制性内切酶酶切后,将SM-NAD-Y104Q基因与表达型质粒pET24b进行连接后转化大肠杆菌BL21(DE3),利用卡那霉素筛选阳性克隆,双酶切验证,DNA测序,筛选出可表达SM-NAD-Y104Q的重组质粒。在IPTG诱导作用下,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达出SM-NAD-Y104Q,分离纯化该蛋白后,测定氧化还原反应体系NADH+H~+在340nm吸光度的减少值,计算SM-NAD-Y104Q的合成苹果酸的酶活性,结果表明突变后的苹果酸酶能有效的结合丙酮酸和二氧化碳,转化生成苹果酸。利用穿梭质粒pMG36e连接SM-NAD-Y104Q表达基因,并且成功结合转移至德氏乳杆菌中,测定了德氏乳杆菌的生长曲线和该菌的苹果酸基本发酵特性,为今后利用德氏乳杆菌作为基因工程改造菌生产苹果酸提供了经验和实验基础。