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定点诱变(site directed mutagenesis,SDM)技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子,进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。定点诱变技术可以分为PCR介导的和非PCR介导的,由于近年来PCR的迅速发展,其PCR介导的定点突变方法应用也越来越广泛,尤其是其中的大引物定点突变方法由于其自身的优点在定点突变方法中具非常重要的地位。但其大引物方法本身也存在一些不足:胶分离纯化大引物过程费时费事,并且全长扩增产物的产率均较低。本试验对传统的大引物突变方法进行了改进,通过采用不对称扩增来消除其多余引物和加入酶DpnI消除野生模版对突变效率的影响并且省去了过程中的凝胶纯化,简化了步骤,节省了时间,其突变效率达到85%。此种方法在应用于植酸酶的定点突变的研究中时,取得了很好的突变效果。植酸酶是催化植酸及其盐类水解成低磷酸化的肌醇和磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。在饲料中添加植酸酶不但可以提高动物对磷的吸收,降低环境中磷的污染,而且能解除植酸对金属离子、氨基酸的螯合作用,大大提高饲料的利用效率,在国内外饲料工业中有着广泛的应用前景。由于黑曲霉来源地植酸酶的最适pH值为5.0,而单胃动物肠道中的pH为3.5左右,因此本试验想通过定点突变方法使其适应肠道中的低pH环境,使其更好的应用于生产。本试验采取改进的大引物方法,对Q278,K281两点进行突变并将突变的基因转入到真核宿主中进行表达。通过与酵母工程菌GA-22的所产植酸酶酶学性质的对比分析,GA-22在pH3.0和pH5.0处各有一个酶活峰,突变菌株EE-1(K281E)的酶活为81696U/mL,提高了酶活的20%,最适pH值为5.0,仅有一个酶活峰。突变菌株EE-2 (K281EQ278L)的酶活力为62376U/mL,最适pH值为5.5,仅有一个酶活峰,在对其热稳定性的研究中时发现在60℃和80℃处理30min后的突变菌株EE-1的相对残余酶活分别为86.6%,79.8%,在60℃和80℃处理30min后的突变菌株EE-2的残余相对酶活力为91.2%,57.2%,而GA-22经过相同处理后的相对残余酶活分别为79.8%,60.2%,得知对双点进行突变时高了工程菌GA-22的热稳定性。