论文部分内容阅读
研究目的我们前期研究发现脂肪因子chemerin水平的降低在有氧运动改善雄性糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱中发挥重要作用,但其作用机制仍未被阐明。近年研究报道了 chemerin能调控雄激素水平,且雄激素对线粒体的功能和结构和生物合成的调控作用是雄激素影响糖脂代谢的重要途径。因此,本研究利用外源chemerin干预和chemerin敲除小鼠（脂肪特异性和全身性敲除）证实chemerin水平降低在运动调控糖尿病或高脂喂养的雄性小鼠糖脂代谢中的作用,是否通过上调雄激素及其受体（androgenreceptor,AR）水平,进而改善线粒体的功能、结构和生物合成实现。研究方法Chemerin干预小鼠:用高脂膳食+STZ法复制糖尿病小鼠。将建模成功的糖尿病小鼠分为糖尿病对照组（DM）、糖尿病运动组（EDM）和糖尿病运动+chemerin干预组（EDM+CHE）;将正常雄性小鼠随机分为对照组（CON）、运动组（E）和chemerin干预组（CHE）。运动组小鼠进行6周中等强度有氧运动;chemerin干预在运动前30 min腹腔注射外源chemerin。检测小鼠空腹血糖（FBG）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、血脂四项;ELISA方法检测血清睾酮和chemerin水平,Western blot方法检测腓肠肌AR、chemerin和CMKLR1的蛋白水平。还检测了腓肠肌的线粒体合成（PGC-1α、NRF-1、TFAM）,融合（OPA1、MFN2）和分裂（DRP1、FIS1）相关蛋白的mRNA（RT-PCR）和蛋白（Western blot）水平。因样本问题,未能检测腓肠肌线粒体的结构和功能。Chemerin敲除（脂肪敲除和全敲）小鼠:雄性野生型（WT）和脂肪cheme rin敲除小鼠（杂合子和纯合子）喂以6周普通饮食（ND）和高脂饮食（HFD）,将其分为安静组和有氧运动组,共12组,分别是ND和HFD下的WT、WT+E、adipo-chemerin（+/-）、adipo-chemerin（+/-）+E、adipo-chemerin（-/-）和 adipo-chemerin（-/-）+E。同样地,将雄性WT和chemerin全敲纯合子小鼠喂以6周ND和HFD后也分为安静组和有氧运动组,获得ND和HFD下的WT、WT+E、chemerin（-/-）和chemerin（-/-）+E,共8组。检测小鼠的体重、体成分、血脂四项、FBG、糖耐量和胰岛素耐量水平、血清睾酮和chemerin水平、腓肠肌chemerin、CMKLR 1和AR蛋白水平。还检测了腓肠肌线粒体的数量和结构（透射电镜）,线粒体呼吸速率（O2K线粒体功能测定系统）和膜电位水平（JC-1试剂盒）,以及上述的线粒体合成、融合和分裂相关蛋白的mRNA及蛋白水平。研究结果第一部分Chemerin调控雄性小鼠的雄激素/AR水平1.外源chemerin干预降低运动糖尿病小鼠的雄激素/AR水平课题组前期研究已证实外源chemerin干预逆转运动对糖尿病小鼠糖脂代谢的改善作用。进一步,本研究发现与CON组比较,DM组小鼠的血清睾酮水平（P＜0.05）、腓肠肌AR蛋白水平（P＜0.01）显著降低。6周有氧运动升高DM小鼠腓肠肌AR蛋白水平（P＜0.01）,且该作用被外源chemerin逆转（P＜0.05）。与EDM组相比,EDM+CHE组小鼠的血清睾酮水平显著下降（P＜0.05）。2.脂肪chemerin敲除对雄性小鼠雄激素/AR水平、血糖血脂等的影响2.1脂肪chemerin敲除对雄性小鼠血清睾酮、腓肠肌AR蛋白水平的影响（1）普通饮食:与WT小鼠比较,脂肪chemerin敲除对血清睾酮水平无显著影响（P＞0.05）。（2）高脂饮食:脂肪chemerin敲除升高安静小鼠血清睾酮水平（P＜0.05）。与运动组WT小鼠比较,脂肪chemerin敲除运动组小鼠的AR蛋白水平显著升高（P＜0.01）。2.2脂肪chemerin敲除对雄性小鼠血糖血脂、糖耐量和胰岛素耐量的影响（1）普通饮食:与WT小鼠比较,脂肪chemerin敲除小鼠的血脂改善（TC、LDL降低、HDL水平升高,均P＜0.05）,糖耐量和胰岛素耐量无变化（P＞0.05）。6周有氧运动改善WT和脂肪chemerin敲除纯合子小鼠的血脂（降低TC、升高HDL,均P＜0.05）,且chemerin敲除小鼠的血脂改善更明显。（2）高脂饮食:与WT小鼠比较,脂肪chemerin敲除小鼠血糖血脂均改善（TC、TG、FBG降低,均P＜0.05）。运动显著降低WT和脂肪chemerin敲除小鼠的FBG水平（P＜0.01）,减少程度两组间无显著差异。3.Chemerin全敲对雄性小鼠雄激素/AR水平、血糖血脂等的影响3.1 Chemerin全敲对雄性小鼠睾酮水平的影响（1）普通饮食:chemerin全敲对安静和运动小鼠血清睾酮水平无影响（P＞0.05）。（2）高脂饮食:与WT小鼠比较,chemerin全敲小鼠的血清睾酮水平显著升高（P＜0.01）。6周有氧运动增加WT（P＜0.01）和chemerin全敲小鼠（P＜0.05）的血清睾酮水平,且chemerin全敲小鼠的睾酮增加更明显。3.2 Chemerin全敲对雄性小鼠血糖血脂、糖耐量和胰岛素耐量的影响（1）普通饮食:chemerin全敲升高小鼠的TC水平（P＜0.01）,对糖耐量和胰岛素耐量水平无影响（P＞0.05）。与运动WT小鼠比较,运动chemerin全敲小鼠的TG和FBG显著下降（P＜0.05）。（2）高脂饮食:chemerin全敲小鼠FBG升高（P＜0.01）,OGTT和ITT曲线下面积降低（P＜0.01）。运动显著降低chemerin全敲小鼠的FBG（P＜0.01）和WT小鼠的LDL水平（P＜0.05）,以及降低WT和chemerin全敲小鼠的OGTT和ITT曲线下面积（P＜0.05）。第二部分Chemerin调控骨骼肌线粒体的结构、功能和生物合成1.外源chemerin干预对运动糖尿病小鼠线粒体相关蛋白的影响与CON组小鼠比较,DM小鼠腓肠肌PGC-1α、NRF-1、TFAM、MFN2、OPA1的mRNA和蛋白水平均显著下调（P＜0.05）。6周有氧运动显著上调DM小鼠中上述分子的mRNA水平以及NRF-1、OPA1和MFN2的蛋白水平（P＜0.05）,且该作用被外源chemerin干预逆转（P＜0.05）。2.脂肪chemerin敲除对雄性小鼠腓肠肌线粒体结构、功能和生物合成相关蛋白的影响（1）线粒体结构和功能:高脂饮食引起WT小鼠腓肠肌线粒体数量减少、线粒体嵴排列紊乱甚至丢失、线粒体空泡化,降低线粒体膜电位水平（P＜0.05）,脂肪chemerin敲除改善上述线粒体紊乱。6周有氧运动改善高脂饮食小鼠线粒体数量和结构的紊乱,且在脂肪chemerin敲除小鼠中改善更明显;运动显著升高脂肪chemerin敲除小鼠的呼吸控制率水平（P＜0.05）,对WT小鼠无影响（P＞0.05）。（2）线粒体生物合成相关蛋白:高脂饮食降低WT小鼠腓肠肌PGC-1α、NRF-1和TFAM的蛋白水平,降低PGC-1α、NRF-1和OPA1的mRNA水平（P＜0.05）。脂肪chemerin敲除逆转高脂饮食对上述线粒体相关蛋白的抑制作用,下调DRP1和FIS1的mRNA和蛋白水平（P＜0.05）。3.Chemerin全敲对雄性小鼠腓肠肌线粒体结构、功能和生物合成相关蛋白的影响（1）线粒体结构和功能:普通饮食下,与WT小鼠比较,chemerin全敲小鼠线粒体膜电位水平显著升高（P＜0.01）。高脂饮食下,与WT小鼠比较,chemerin全敲小鼠线粒体密度增大、嵴增多,线粒体复合物Ⅱ的呼吸速率和膜电位水平升高（P＜0.01）。6周有氧运动显著增加普通饮食、高脂饮食WT和chemerin全敲小鼠腓肠肌中线粒体的数量及功能（P＜0.05）。（2）线粒体生物合成相关蛋白:普通和高脂饮食下,与WT小鼠比较,chemerin全敲小鼠腓肠肌NRF-1的蛋白水平升高（P＜0.05）,DRP1（P＜0.01）和FIS1（P＜0.01）的蛋白水平降低。与运动组WT小鼠比较,运动组chemerin全敲小鼠NRF-1（P＜0.05）蛋白水平升高,FIS1蛋白水平显著下调（P＜0.05）。研究结论1.Chemerin水平降低在有氧运动改善雄性糖尿病小鼠糖脂代谢中的作用,与其增加睾酮和腓肠肌AR蛋白水平、增强腓肠肌线粒体生物合成有关。2.Chemerin对雄激素/AR水平有负调控作用。6周有氧运动改善高脂喂养雄性chemerin敲除（脂肪敲除和全敲）小鼠血脂和血糖的作用,与其增加血清睾酮和腓肠肌AR水平有关。3.Chemerin敲除（脂肪敲除和全敲）对雄性高脂喂养的运动小鼠腓肠肌线粒体,有改善结构、提高功能和增强线粒体生物合成的作用。鉴于大量文献已证实雄激素/AR对线粒体数量、结构、功能和线粒体生物合成的促进作用,以及线粒体在糖脂代谢中的重要作用,我们认为chemerin调控雄激素/AR水平、进而影响骨骼肌线粒体水平和功能,是chemerin参与有氧运动调控雄性小鼠糖脂代谢的一个新机制。