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研究背景: 肠源性感染是全身性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能不全(MODS)重要的始动因素。当肠道菌群失调、炎症反应和免疫功能调节失控时，可以引起肠道机械屏障损伤，表现为肠黏膜上皮细胞萎缩，细胞间紧密连接分离、变宽、损害，导致上皮通透性增加，发生细菌易位(bacterial translocation)，使肠内细菌及其他致病抗原进入肠黏膜间质，从而引起远离肠道的其他器官、组织发生感染，导致肠源性感染，甚至诱发全身性炎症反应综合征(SIRS)和MODS等。[1-3]目前研究发现缺氧导致的肠上皮细胞的能量和物质代谢功能紊乱是促使肠上皮屏障功能(IEB)损伤的关键因素。Hedgehogs(Hh)是一个与形态发生有关的信号通路，介导多个器官包括面部、神经系统、四肢以及消化道等的发育[6-7]。出生后Hh信号通路在组织器官功能维持如组织内环境稳定、组织的修复及肿瘤发生过程亦发挥了关键性作用。多种研究发现肠上皮来源的Hh通过旁分泌方式对肠上皮(IEC)的生长和动态平衡的维持发挥了重要作用[8-10]。尽管已知Hh对IEC的增殖具有重要作用，但其在肠道缺氧导致的IEB功能损伤中的作用尚少见文献报道。 缺氧刺激导致的细胞能量和物质代谢紊乱是由一系列细胞因子介导的，其中位于中枢位置的HIF-1α和NF-κB。其中NF-κB可能是Hh通路的上游正调节因子。TNF、IL-1β、LPS诱导的炎症刺激活化NF-κB可增加Hh的表达，而阻断NF-κB可抑制Hh表达。在缺氧的相关研究中亦发现HIF-1α处于Hh的上游，缺氧时HIF-1α激活的同时，Hh亦有高表达，但干扰HIF-1α后Hh信号通路被抑制。进一步研究发现HIF-1α可通过激活Hh启动子和上调NF-κB直接或间接提高Hh表达水平。另外调节肠上皮间紧密连接蛋白功能的囊泡转运蛋白Rab23可能是Hh信号的一种负调节因子。Rab23可作用于Gli的上游，通过促进Gli3抑制子的产生、抑制Gli2的激活子抑制Hh信号通路[16-18]。基于以上研究，我们猜测Hh可在肠缺氧条件下被激活，并通过影响IEC细胞间紧密连接蛋白的表达介导缺氧导致的IEB功能改变。 研究目的: 1、比较常氧和缺氧条件下大鼠肠黏膜和IEC-6细胞系中Hh信号通路各因子活性的差异。 2、观察缺氧条件下Hh特异性抑制剂cyclopamine对IEC-6细胞中Hh信号通路转录和表达影响。 3、观察常氧和缺氧条件下IEC-6细胞上皮间跨膜电阻抗(Transepithelial Resistance，TER)和上皮间紧密连接蛋白(tight junction，TJ)表达的变化。 4、探索常氧和缺氧条件下cyclopamine对IEC-6细胞TER和TJ分子的转录、蛋白表达的影响。 研究方法: 1、建立大鼠肠道I/R损伤模型，通过蛋白印迹以及RT-PCR技术，测定大鼠肠黏膜中Hh信号途径活化规律。 2、建立肠隐窝上皮细胞系IEC-6缺氧及cyclopamine干预模型，通过蛋白印迹以及RT-PCR测定大鼠上皮细胞Hh信号途径活化规律。 3、通过transwell小室细胞培养、TER测定技术，了解缺氧及cyclopamine干预情况下肠上皮细胞TER的变化情况。 4、通过蛋白印迹及RT-PCR技术，检测缺氧+cyclopamine干预对肠隐窝上皮细胞IEC-6中的TJ蛋白表达的影响，明确Hh通路在缺氧介导的IEB功能损伤中的作用及机制。 研究结果: 1、大鼠肠道I/R模型中Hh信号通路主要分子IHH、PTCH、Gli1 mRNA显著升高（分别为600.5％、189.1％、631.9％VS假手术组，P＜0.05）。其蛋白表达较常氧组亦有明显升高（370.3％、210.0％、411.3％VS假手术组，P＜0.05）。 2、缺氧是激活I/R条件下大鼠肠黏膜Hh信号通路激活的重要因素。IHH、PTCH、Gli1在缺氧条件下转录活性显著升高(分别为740.1％、179.0％、655.1％VS常氧组，P＜0.05)，其蛋白表达较常氧组亦有明显升高(277.5％、201.7％、316.4％VS常氧组，P＜0.05)。 3、缺氧可导致IEC-6细胞跨上皮电阻TER下降(减少27.69％)并导致上皮间紧密连接蛋白ZO-1、claudin1、occludin表达下调（48.7％、40.0％、55.6％VS常氧组，P＜0.05）。 4、cyclopamine可部分阻止缺氧导致的IEC-6细胞TER下降（升高16.4％VS常氧组）和上皮间紧密连接蛋白ZO-1、claudin1、occludin表达下调(升高59.9％、35.2％、65.1％VS缺氧组，P＜0.05)。 结论: 我们前期研究发现肠道I/R时出现明显的IEB损害，其中缺氧是肠道I/R介导IEB破坏的关键因素。本研究在探索缺氧导致的IEB功能损害机制时发现，肠道I/R和缺氧可激活Hh信号通路，并证实Hh特异性抑制剂cyclopamine可通过部分阻止ZO-1、Occludin、claudin-1等TJ分子表达下调来改善缺氧导致的IEC功能损伤，表明Hh信号通路可通过减少TJ分子的表达来降低肠上皮细胞TER值，破坏IEB功能。