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目的:体外培养人真皮成纤维细胞,用无机砷及其代谢物进行染毒,观察染毒后细胞增殖、周期及凋亡,并检测DNA修复相关的XPA、XPC、PARP1、ERCC3基因的表达变化,探讨砷及其代谢物导致细胞皮肤损伤的分子机制。 方法:1、从6~10岁的8例健康儿童志愿者中,取包皮组织进行原代培养、分离人真皮成纤维细胞(Fibroblast)。传代培养至第10代后,分别以无机砷化合物亚砷酸钠(Sodiumarsenate,Na2AsO2)、二甲基胂酸(Dimethylarsinic arsenical,DMAⅤ)、单甲基胂酸(Monomethylated arsenical,MMAⅢ)进行染毒,混匀分为4组,即高、中、低、对照组。在72 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,检测不同浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII(0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、25μmol/L)对人真皮成纤维细胞体外增殖的变化。2、流式细胞仪(Flow cytometer)检测不同浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII(0μmol/L、5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L)刺激人真皮成纤维细胞的凋亡和周期变化状况。3、通过实时荧光定量(Real-Time Quantitative PCR)检测不同浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII(0μmol/L、5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L)刺激人真皮成纤维细胞后,修复基因XPA、XPC、PARP1、ERCC3的表达水平。 结果:1、人真皮成纤维细胞通过MTT比色法检测得出结果:和对照组对比,人真皮成纤维细胞经不同浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII刺激后,吸光度值发生变化,存在剂量-反应关系(P<0.05);2、用0μmol/L、5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L的iAsIII、DMAV、MMAIII的浓度作用人真皮成纤维细胞,G0/G1期细胞比例明显下降(P<0.05),G2/M期和S期细胞比例较对照组明显增加(P<0.05);高、中剂量iAsIII、DMAV、MMAIII处理组细胞G1期细胞所占百分数增多,提示细胞在G1期出现阻滞的趋势,G2和S期细胞所占百分数较少。3、XPA、XPC、PARP1、ERCC3在iAsIII、DMAV、MMAIII药物作用下,mRNA在0~10μmol/L浓度的表达量出现上升趋势,而随着iAsIII、DMAV、MMAIII药物作用浓度的增加,在15~25μmol/L浓度的mRNA表达量显示有下降趋势,有统计学意义(P<0.05)。 结论:在细胞增殖试验中,不同浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII诱导人真皮成纤维细胞后,吸光度产生了明显的变化,0~10μmol/L浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII对人真皮成纤维细胞有促进细胞增殖作用,而15~25μmol/L浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII对人真皮成纤维细胞有抑制细胞增殖作用。0~10μmol/L浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII对人真皮成纤维细胞促进 XPA、XPC、PARP1、ERCC3基因的表达,15~25μmol/L浓度的iAsIII、DMAV、MMAIII对人真皮成纤维细胞抑制 XPA、XPC、PARP1、ERCC3基因的表达。