乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一,严重危及女性生命健康。尽管乳腺癌早期诊断和治疗的方法在不断更新,但是乳腺癌仍然稳居全世界女性癌症相关死亡原因的首位。早期检测和发现是提高乳腺癌患者生存率的至关重要因素,通过分子生物学方法对肿瘤发生过程中异常表达的基因进行研究、寻找肿瘤特异的分子生物学标记,在乳腺癌早期诊断和个体化治疗的靶点选择中有重要意义。Neogenin是一种在生物体各组织中广泛表达的I型跨膜糖蛋白,由1461个氨基酸编码,分子量为160-190k Da,属于结直肠癌缺失蛋白(deleted in colorectal cancer,DCC)家族和免疫球蛋白超家族的成员。Neogenin蛋白与配体结合后,参与细胞内信号传导,在生物体胚胎发育和成体各组织的发育过程中发挥重要作用。此外,Neogenin在配体缺失的情况下,可以作为依赖性受体发挥作用,促进细胞凋亡。Neogenin在哺乳动物的胚胎中和成体的各个组织中表达很广泛,不仅促进胚胎的发育,在哺乳动物成体的神经管发育、细胞迁移、组织发育和组织分化、血管形成、信号转导和细胞调亡过程也发挥重要作用。近年的研究发现,DCC家族的成员在肿瘤中可以发挥抑癌因子的作用;同时,在包括脑神经胶质瘤、胃癌、食管鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌在内的多个肿瘤中,也发现了Neogenin基因的异常表达,这些研究结果提示Neogenin可能在这些肿瘤的发生、进展中发挥重要作用。另有研究发现,通过特定条件诱导衍生的同一来源、侵袭能力不同的三种乳腺癌细胞,随着乳腺癌细胞侵袭能力的增强,Neogenin的表达呈降低趋势。这些研究结果提示Neogenin在乳腺癌中可能发挥抑癌因子的作用,并可能作为预后判定的一个指标。然而,Neogenin在乳腺癌组织中表达情况,Neogenin是否与乳腺癌的发生、进展有关,以及对于临床乳腺癌患者Neogenin表达的临床意义,国内外尚无相关研究及报道。在本研究中,首先通过Real-time PCR和Western blot方法检测乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系中Neogenin的表达趋势;随后,通过质粒转染技术,在乳腺癌MDA-MB-231细胞中过表达Neogenin,并分析其对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡、迁移和细胞周期等方面的影响,探讨Neogenin在乳腺癌中的作用和分子机制;此外,采用免疫组织化学染色和Real-time PCR检测了54例乳腺导管癌及配对癌旁组织中Neogenin的表达情况,并与乳腺癌预后相关的实验室及临床指标进行比较、分析之间的相关性,探讨对于乳腺癌患者Neogenin表达的临床意义,肯定了Neogenin作为乳腺癌个体化治疗潜在靶点的地位。实验方法:1.培养正常乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌MCF-7、BT-549和MDA-MB-231细胞,Real-time PCR和Western blot检测以上四株细胞中Neogenin m RNA和蛋白的表达水平。2.通过脂质体将pc DNA3.1-e GFP-Neogenin质粒和pc DNA3.1-e GFP空载质粒转染MDA-MB-231细胞,荧光显微镜观察转染效率。采用Real-time PCR和Western blot对Neogenin过表达进行验证。3.通过CCK8法绘制细胞生长曲线、PI法检测细胞周期、TUNEL法观察上调Neogenin表达后,MDA-MB-231细胞在增殖和凋亡方面的变化,并通过Real-time PCR检测增殖、凋亡相关基因的m RNA表达水平,探讨Neogenin对细胞增殖和凋亡产生影响的分子机制。4.通过细胞划痕法、Boyden小室法观察上调Neogenin表达后,MDA-MB-231细胞在迁移和侵袭能力方面的变化,并通过Real-time PCR检测迁移和侵袭相关基因的m RNA表达变化,探讨Neogenin对细胞迁移和侵袭产生影响的分子机制。5.免疫组织化学染色和Real-time PCR法检测54例乳腺导管癌组织和配对癌旁组织中Neogenin蛋白及m RNA的表达情况。根据临床及病理资料分析Neogenin基因在乳腺癌患者中的表达与乳腺癌患者临床指标、病理指标、预后指标的关系。实验结果:1.Real-time PCR和Western blot结果显示:与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,Neogenin在三种乳腺癌细胞株中的m RNA及蛋白的表达均降低;且Neogenin的表达水平与乳腺癌细胞的转移潜能呈负相关趋势。2.荧光显微镜、Real-time PCR和Western blot结果证实:pc DNA3.1-e GFP-Neogenin质粒和pc DNA3.1-e GFP空载质粒成功转染并获得了较高的转染效率,在MDA-MB-231细胞中有效上调了Neogenin m RNA和蛋白的表达。3.上调Neogenin后MDA-MB-231细胞的增殖受到抑制、细胞周期G1→S期的进程延缓、细胞凋亡比率增高。Real-time PCR结果显示上调Neogenin后,凋亡抑制基因Bcl-2和c-Myc表达水平明显下降,而CTGF、Med19、RPL13、Jun B、Suvivin表达水平无明显变化(p<0.05)。4.上调Neogenin后MDA-MB-231细胞的迁移及侵袭能力受到抑制。Real-time PCR结果显示上调Neogenin后,促进迁移和侵袭的Vimentin、MMP-2和MMP-9基因的m RNA表达水平明显下降,而抑制迁移和侵袭的TIMP3基因的m RNA的表达水平升高(p<0.05)。5.Neogenin在人乳腺癌组织中的表达及其临床意义5.1免疫组织化学染色结果显示:1Neogenin在54例癌旁组织中为中等强度的表达,表达部位位于细胞膜;2Neogenin在54例乳腺癌组织中,13例为阴性(24.1%)、35例为弱阳性(64.8%)、6例为中度阳性(11.1%),在乳腺癌组织中的表达部位位于胞浆。5.2 Real-time PCR结果显示:与配对癌旁组织相比,乳腺癌组织中Neogenin的m RNA表达水平下降者占94.4%(51/54),表达升高者仅占5.6%(3/54)。将各自配对的癌旁组织中Neogenin的表达水平标准化为1,Neogenin在54例乳腺癌组织中的相对表达量的平均值为0.264±0.0330,Neogenin在乳腺癌组织中表达下降(p<0.05)。5.3 Neogenin与乳腺癌病理组织分级的关系:病理组织分级II级的乳腺癌Neogenin的m RNA相对定量平均值为0.330±0.034,III级为0.192±0.031,二者具有明显的统计学差异(p<0.05)。Neogenin的m RNA表达水平与乳腺癌病理组织分级呈负相关趋势。5.4 Neogenin与乳腺癌预后相关实验室指标的关系:根据54例乳腺癌样本实验室检测的生物学标记将患者分组。1ER阴性组Neogenin表达水平更低(0.221±0.029 vs.0.309±0.036);2PR阴性组Neogenin表达水平更低(0.256±0.034vs.0.279±0.031);3 HER-2阳性组Neogenin表达水平更低(0.239±0.029 vs.0.281±0.035);4 Ki67阳性组Neogenin表达水平更低(0.256±0.033 vs.0.287±0.035);5 p53阴性组Neogenin表达水平更低(0.237±0.030 vs.0.308±0.037)。但上述结果差异不显著。5.5 Neogenin与乳腺癌临床预后指标的关系:根据54例乳腺癌患者的临床资料将患者分组。1老年性乳腺癌组Neogenin表达水平更低(以65岁为老年界限:0.042±0.003 vs.0.270±0.032)(以60岁为老年界限:0.141±0.020 vs.0.278±0.033);2肿瘤直径>20mm组Neogenin表达水平更低(0.237±0.028 vs.0.298±0.037);3无淋巴结转移组Neogenin表达水平最低为0.164±0.025,(1~3枚淋巴结转移组:0.379±0.035,4~9枚淋巴结转移组:0.258±0.035,≥10枚淋巴结转移组:0.330±0.038);4 TNM分期I期Neogenin表达水平最低为0.206±0.319(II期:0.292±0.322,III期:0.254±0.357,IV期:0.302±0.368);5脉管神经浸润组Neogenin表达水平更低(0.247±0.026 vs.0.272±0.035);6Luminal A型乳腺癌Neogenin表达水平最高为0.407±0.400,H型乳腺癌中最低为0.199±0.236(Lumianl B型:0.217±0.314;三阴性乳腺癌:0.244±0.356)。由于样本例数原因,上述结果差异并不显著。结论:1.Neogenin在乳腺癌细胞中表达降低,且Neogenin的表达与乳腺癌细胞转移能力呈负相关的趋势。提示Neogenin可能作为乳腺癌转移能力预测的指标。2.乳腺癌细胞中过表达Neogenin后,抑制了细胞增殖、迁移和侵袭的能力,阻滞细胞周期的进展、促进细胞的凋亡。提示Neogenin表达上调可能对乳腺癌起到抑制作用,Neogenin在乳腺癌中可能发挥抑癌因子的作用。3.Neogenin可能通过抑制Bcl-2、c-Myc基因的表达抑制乳腺癌细胞的增殖、促进其凋亡;Neogenin可能通过抑制MMP-2、MMP-2、Vimentin基因的表达并促进TIMP-3基因的表达,抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭,但具体机制仍有待于进一步研究。4.Neogenin在乳腺癌组织中表达降低,与乳腺癌病理组织学分级呈负相关趋势(P<0.05)。Neogenin在老年性乳腺癌、淋巴结阴性乳腺癌、I期乳腺癌中表达降低,在Luminal A型乳腺癌中表达最高。提示Neogenin可能参与乳腺癌发生、发展的过程,为Neogenin作为乳腺癌预后判定因素提供了理论依据。