第一部分合并HBV感染对弥漫大B细胞淋巴瘤患者免疫化疗疗效的影响背景及研究目的 弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma, DLBC L)是我国最常见的淋巴瘤病理亚型。HBV感染与DLBCL发病存在相关性,同时也是DLBCL常见合并症。合并HBV感染者接受化疗后HBV再激活已得到大量研究关注；然而合并HBV感染对DLBCL患者接受化疗后疗效及预后影响尚未得到公认,需进一步阐明。本部分为多中心临床研究,通过回顾性分析不同HBV感染状态的DLBCL患者接受不同治疗方案后的临床疗效及转归,评价HBV感染对患者预后的影响；同时通过多因素回归分析明确影响患者预后的主要危险因素。材料与方法 对1997年4月至2008年11月上海地区6所三甲医院的384名DLBCL患者进行回顾性分析。根据患者HBV感染状态及是否接受利妥昔单抗治疗进行分组,比较各组患者无进展生存期(progression free survival, PFS)及总生存期(overall survival, OS),同时采用Cox回归分析探讨HBsAg阳性是否为DLBCL患者PFS及OS的独立影响因素。结果 1、在CHOP方案组中,HBsAg阳性与否对于患者PFS及OS不存在显著影响。在R-CHOP方案组中,HBsAg阳性患者在PFS及OS均显示出显著的生存劣势(p=0.031及p=0.006)。2、以患者年龄及侵袭性淋巴瘤国际预后指数(International Prognostic Index, IPI)其余各参数(ECOG2-4、LDH升高、结外病灶>=2处、Ann Arb or分期Ⅲ-Ⅳ期)进行校正,HBsAg为PFS及OS独立的不良预后因素(RR=2.681及RR=3.344,P<0.05)。结论 1、本研究在使用单纯R-CHOP方案化疗的DLBCL患者中,未发现合并HBV感染患者生存与非感染患者间存在显著差异；而在接受联合免疫化疗(R-CHOP方案)患者中,伴有HBV感染者具有明显的生存劣势；2、HBsAg为HBV感染最主要的血清学标志,在联合免疫化疗时代已成为DLBCL患者独立的生存预后因素。第二部分HBsAg阳性弥漫大B细胞淋巴瘤患者化疗过程中相关细胞免疫变化情况研究背景及目的 病毒感染相关的淋巴瘤发病及预后机制主要包括：整合宿主基因组导致肿瘤相关基因的激活或肿瘤抑制性基因的失活,或影响宿主细胞免疫功能,导致免疫监视能力下降继而发生肿瘤。HBV慢性感染乃至肝炎后肝硬化患者的细胞免疫功能改变已经得到大量研究关注和证实,因此HBV感染对DLBCL患者预后影响的机制可能主要为后者。目前HBV感染对DLBCL患者在化疗过程中T淋巴细胞各亚群变化的规律尚未明确,因此本部分研究旨在验证第一部分研究结论,并在此基础上进一步观察HBsAg阳性DLBCL患者化疗过程中T细胞免疫的特征及变化规律,由此探索细胞免疫状态对HBsAg阳性DLBCL患者生存影响的可能机制。材料与方法 1、纳入294例住院初治DLBCL患者进行回顾性队列研究,采用四色流式分析患者起病时、化疗2-4月间、化疗4-6月间及化疗6-12月间的外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞计数及CD4+/CD8+细胞比例变化；2、纳入21例初治HBsAg阳性DLBCL患者,以同性别,分期及IPI积分的HBsAg阴性患者1：2构建对照组进行病例对照研究。分析各组患者接受足疗程R-CHOP方案后PFS及OS,同时比较初发及4疗程治疗后外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞计数及CD4+/CD8+比例；3、纳入10例初治HBsAg阳性DLBCL患者,以同性别,分期及IPI积分的HBsAg阴性患者20例构建阴性对照组,20例健康者作为正常对照组,分析各组初发病及化疗4疗程后CD4+CD25+CD127lowT调节细胞(Treg)及CD8+CD28-T抑制细胞(Ts)变化情况；4、分析67例DLBCL患者血清标本细胞因子TNF-α, sIL-2r, IL-6, IL-10水平(其中缓解期患者41例,含HBsAg阳性10例,HBsAg阴性31例；初发DLBCL患者28例,健康体检者20例)。结果 1、HBsAg阳性患者,CD4+细胞计数在接受化疗最初6个月内显著低于HBsAg阴性患者；HBsAg阳性患者CD4+/CD8+比例降低,在化疗中后期(4-6月),相比HBsAg阴性者出现显著差异；2、在R-CHOP初治DLBCL患者中进行病例对照研究,证实HBsAg阳性患者具有较差的PFS(p=0.043)及OS(p=0.021)。Cox多因素回归分析显示经过化疗中期CD8+细胞计数校正,HBsAg对于患者OS仍然存在独立预测作用,相对危险度为4.082；但是HBsAg对患者PFS的预测作用消失,提示细胞免疫因素部分参与了HBV对于DLBC L预后的影响。化疗中期CD8+细胞计数为PFS及OS的独立预后因素。3、R-CHOP初治DLBCL患者的外周血Treg及Ts分析表明,DLBCL患者治疗前后Treg及Ts水平相比健康者明显升高；其中HBsAg阳性患者治疗过程中存在Treg的显著升高。4、初治DLBCL患者及R-CHOP治疗后缓解期患者血清TNF-α及sIL-2r水平均显著高于健康者,缓解期患者整体TNF-a及sIL-2r水平相比初发患者显著降低；缓解期HBsAg阳性患者sIL-2r水平显著高于HBsAg阴性患者。结论 1、接受R-CHOP方案初治DLBCL患者中,HBsAg阳性为患者生存的不良预后因素：其作用可能与细胞免疫有关；化疗中期的CD8+细胞计数具有独立的预后意义；2、HBsAg阳性DLBCL患者在接受免疫化疗过程中,细胞免疫水平动态变化的特征表现为：化疗早期即出现CD4+计数显著降低,化疗中期出现CD4+/CD8+比例降低,同时出现Treg细胞的显著增高；3、HBsAg阳性DLBCL患者在缓解期sIL-2r水平仍然显著高于HBsAg阴性者,有助于解释HBsAg阳性DLBCL患者Treg水平在治疗过程中显著增高。第三部分HBsAg阳性DLBCL患者的外周血T细胞受体Vp基因谱型分析研究背景与目的DLBCL患者出现外周血克隆性增殖T淋巴细胞,并出现优势利用T细胞受体(T Cell Receptor, TCR)谱型的情况,为机体针对肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原作出的适应性选择；同时在病毒感染性疾病中也发现抗原刺激造成TCR谱型偏移的适应性改变。但HBV感染与DLBCL合并存在时,患者外周血TCR谱型偏移变化情况是否与不伴有HBV感染的DLBCL患者类似,或与HBV感染类似,目前尚无相关研究。因此本部分研究采用定量RT-PCR法进行外周血TCRVβ基因谱型分析,以健康体检者标本建立的外周血TCRVβ基因谱型作为正常对照；研究HBsAg阳性及HBsAg阴性DLBCL外周血TCR谱型分布特征,并通过与乙肝后肝硬化患者比较,探寻HBV感染对DLBCL化疗患者外周血TCRVβ基因谱型的影响,为进一步阐明HBV感染对DLBCL患者预后影响寻找线索。方法 1、建立实时定量RT-PCR (SYBR Green法)外周血TCRVβ基因谱型分析的方法,24个Vp亚家族基因表达量以其占所有Vβ相对表达量的百分比表示。体检健康者外周血标本10份建立正常对照谱型正常值范围,超过体检健康者均值3个标准差范围外的Vβ亚家族记为存在优势利用；2、大颗粒T淋巴细胞白血病患者及T细胞幼淋细胞白血病各一例,与送检流式抗体分析TCRVβ基因谱型进行比对；3、乙肝后肝硬化患者标本9份、HBsAg阳性DLBCL患者标本15例,HBsAg阴性DLBCL患者标本20例检测并对优势利用TCR谱型的情况进一步分析比较。结果 1、两例外周血T细胞克隆性肿瘤患者标本使用荧光实时定量RT-PCR均检出明显优势利用的TCRVβ基因谱型,与流式抗体检测结果类似；2、所有检测乙肝后肝硬化患者标本(9/9)、所有HBsAg阴性DLBCL患者标本(20/20)及大部分HBsAg阳性DLBC L患者(14/15)中检出优势利用的Vβ亚家族,主要为Vβ6、Vβ7、Vβ11、Vβ12及Vβ21,优势利用Vp亚家族在各组患者间分布无显著差异；3、Vβ亚家族相对表达量超过正常对照10SD范围之外的标本,在HBsAg阴性DLBCL患者(4/20)中较少,明显多于HBsAg阳性DLBCL患者(8/15),存在显著统计学差异(p=0.039)；而与乙肝肝硬化患者(7/9)类似(p=0.389)。结论 建立了荧光实时RT-PCR法进行外周血TCRVβ基因谱型分析的方法,在此基础上发现本研究中大部分DLBCL患者均存在不同程度的TCRVβ基因亚家族优势利用现象,其中HBsAg阳性患者相比HBsAg阴性患者的优势利用程度更为显著,其意义及对患者生存预后的影响尚有待进一步分析。