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骨重建实质就是新骨代替旧骨的过程,它是由骨吸收与骨形成两部分组成的动态过程。一般来讲,首先是破骨细胞释放酸及酶去溶解那些旧骨或者不规则骨（骨吸收）,然后成骨细胞粘附到骨吸收表面同时分泌细胞外基质矿化,最终分化为骨细胞,形成新骨（骨形成）。其中参与的主要细胞有成骨细胞、骨细胞及破骨细胞。骨髓腔有两种干细胞,分别是间充质干细胞（BMSCs）与造血干细胞（HSCs）,成骨细胞与骨细胞是由BMSCs分化而来,而破骨细胞则是由HSCs分化而来。常见骨重建主要为生理性骨重建及骨修复骨重建（如骨折愈合）。影响骨重建的相关疾病有很多,其中影响最大是骨折愈合。骨折是临床上十分常见的一种疾病,虽然当今治疗的方法比较成熟,绝大多数患者最终可达到完全愈合,但是愈合时间过长,严重影响患者工作能力及生活质量,故有必要进一步研发促进骨折愈合的治疗方法。骨折愈合两种方式分别为膜内骨形成与软骨内骨形成,均与骨重建密切相关,通过前期数据分析及筛选,我们推测成骨细胞中 Neogenin 及骨骼肌细胞中 Low-density lipoprotein receptor-related protein4（LRP4）对骨重建影响较显著,故本研究将探索成骨细胞中Neogenin及骨骼肌细胞中LRP4对生理性骨重建及骨折愈合的影响。第一章:成骨细胞中Neogenin对骨重建的影响目的:探讨成骨细胞中Neogenin对骨重建的影响,并进行相关验证。材料与方法:1.构建NeogeninOCN-CRE成骨细胞基因敲除小鼠,其同窝Neogeninflox/flox小鼠为对照,并进行繁殖;2.3月龄小鼠股骨骨折模型构建,2周后处死取材,骨组织固定、脱钙、包埋、切片;3.苏木素-伊红（HE）染色检测Neogeninflox/flox及NeogeninOCN-CRE小鼠骨量,并经Image J图像分析软件分析骨量变化情况;4.钙黄绿素双标实验及Enzyme-linked immune sorbent assay（ELISA）[血清Osteocalcin（OCN）]实验与抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）染色及 ELISA[血清 Pyridinoline（PYD）]实验分别检测 Neogeninflox/flox及NeogeninOCN-CRE小鼠骨形成及骨吸收,并经Image J图像分析软件分析骨形成及骨吸收变化情况;5.提取3月龄Neogeninflox/flox及NeogeninOCN-CRE小鼠原代BMSCs诱导成骨,诱导2周后行碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨分化状态,并经Image J图像分析软件分析成骨分化情况。结果:1.NeogeninOCN-CRE敲除组小鼠骨小梁面积显著大于Neogeninflox/flox对照组,但骨皮质面积变化不明显,提示成骨细胞中Neogenin敲除可促进骨小梁生理性骨重建;2.NeogeninOCN-CRE敲除组小鼠钙黄素标记钙沉积面积及血清OCN表达水平明显大于Neogeninflox/flox对照组,Trap标记破骨细胞面积及血清PYD表达水平与对照组相比则无明显差异,提示成骨细胞中Neogenin敲除通过促进骨形成促进生理性骨重建;3.小鼠股骨骨折造模2周后,NeogeninOCN-CRE敲除组小鼠骨折处骨痂面积明显大于Neogeninflox/flox对照组,提示成骨细胞中Neogenin敲除可促进骨折愈合;4.NeogeninOCN-CRE敲除组小鼠骨折处骨痂钙黄绿素标记钙沉积面积明显大于Neogeninflox/flox对照组,Trap标记破骨细胞面积与对照组相比则无明显差异,提示成骨细胞中Neogenin敲除通过促进骨形成促进骨折愈合;5.提取NeogeninOCN-CRE敲除组及Neogeninflox/flox对照组小鼠原代BMSCs细胞诱导成骨分化,NeogeninOCN-CRE敲除组小鼠ALP阳性细胞面积明显小于Neogeninflox/flox对照组,提示成骨细胞中Neogenin敲除抑制成骨分化。结论:成骨细胞中Neogenin敲除通过促进骨形成促进生理性骨重建及骨折愈合。第二章:骨骼肌细胞中LRP4对骨重建的影响目的:探讨骨骼肌细胞中LRP4对骨重建的影响,并进行相关验证。材料与方法:1.构建LSL-LRP4-FL-HSA-CRE骨骼肌细胞基因过表达组小鼠,其同窝LSL-LRP4-FL小鼠为对照,并进行繁殖;2.3月龄小鼠股骨骨折模型构建,2周后处死取材,骨组织固定、脱钙、包埋、切片;3.HE染色检测LSL-LRP4-FL及LSL-LRP4-FL-HSA-CRE小鼠骨量,并经Image J图像分析软件分析骨量变化情况;4.构建LSL-LRP4-LDLa-HSA-CRE、LSL-LRP4-δβ1-HSA-CRE、LSL-LRP4-δβ3-HSA-CRE骨骼肌细胞基因过表达小鼠,其同窝LSL-LRP4-LDLa、LSL-LRP4-δβ1、LSL-LRP4-δβ3 小鼠为对照,并进行繁殖;5.3月龄小鼠股骨骨折模型构建,2周后处死取材,骨组织固定、脱钙、包埋、切片;6.HE 染色检测 LSL-LRP4-LDLa、LSL-LRP4-δβ1、LSL-LRP4-δβ3 及LSL-LRP4-LDLa-HSA-CRE、LSL-LRP4-δβ1-HSA-CRE、LSL-LRP4-δβ3-HSA-CRE小鼠骨量,并经Image J图像分析软件分析骨量变化情况。结果:1.LSL-LRP4-FL-HSA-CRE过表达组小鼠骨皮质及骨小梁面积均显著小于LSL-LRP4-FL对照组,提示骨骼肌细胞中LRP4过表达抑制骨皮质及骨小梁生理性骨重建;2.LSL-LRP4-δβ3-HSA-CRE过表达组小鼠骨皮质及骨小梁面积均显著小于 LSL-LRP4-δβ3 对照组,而 LSL-LRP4-LDLa-HSA-CRE、LSL-LRP4-δβ1-HSA-CRE过表达组小鼠骨皮质及骨小梁面积与其对照组相比未见明显变化,提示骨骼肌细胞中LRP4过表达通过其δβ3段抑制生理性骨重建;3.LSL-LRP4-FL-HSA-CRE过表达组小鼠骨折处骨痂面积与其对照组相比未见明显变化,提示骨骼肌细胞中LRP4过表达对骨折愈合过程无明显影响。结论:骨骼肌细胞中LRP4通过其δβ3段抑制生理性骨重建,但对骨折愈合过程无显著影响。