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非小细胞肺癌(non–small-cell lung cancer,NSCLC)肿瘤组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变状态与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)的疗效密切相关。然而在某些情况下,肿瘤组织量不足、肿瘤细胞成分过少或肿瘤组织获取困难都会导致依赖组织的EGFR基因突变检测无法进行。目前,应用血浆或血清进行EGFR基因检测的方法并未被当前指南所认同,或未在临床实践中广泛应用于指导EGFR-TKI的治疗。因此,仍有必要寻找敏感的非侵入性的应用肿瘤组织替代物进行EGFR基因突变状态评估的新方法。近年来,由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)发展而来的蛋白质指纹图谱技术被广泛应用于筛选疾病诊断、疗效预测和预后相关标志物。目前,尚未有研究者应用蛋白质指纹图谱技术建立血清多肽/蛋白分类模型来评估NSCLC患者的EGFR基因突变状态。第一部分:EGFR基因敏感突变的晚期NSCLC患者临床特征及其EGFR-TKI疗效分析目的:探讨EGFR基因敏感突变的晚期NSCLC患者临床特征,分析晚期NSCLC患者EGFR基因突变状态与EGFR-TKI疗效的关系。方法:对2011年5月至2014年4月就诊于解放军307医院肺部肿瘤内科的352名EGFR基因突变状态明确(扩增阻碍突变系统[amplification refractory mutation system,ARMS]法检测肿瘤组织)的IIIB/IV期非小细胞肺癌患者临床资料、影像学资料及随访资料进行回顾性分析。结果:入组患者中,EGFR基因突变和野生型患者在年龄、病理类型、分期方面无显著差异;但在性别、吸烟史方面具有统计学差异,EGFR基因突变患者中女性和非吸烟者所占比例较野生型高。入组的352名晚期NSCLC患者中,250名具有可测量病灶并接受EGFR-TKI治疗。该250名患者中,EGFR基因突变和野生型患者的ORR分别为58.1%(93/160)vs.10.0%(9/90),具有统计学差异(p<0.001);该两组患者的DCR分别为83.8%(134/160)vs.35.6%(32/90),同样具有统计学差异(p<0.001)。EGFR基因突变患者的中位PFS为10.0(95%CI,9.0-10.9)个月;EGFR基因野生型患者的中位PFS为2.0(95%CI,1.8-2.1)个月,EGFR基因突变患者的PFS明显长于EGFR基因野生型患者(p<0.001)。EGFR基因突变患者的中位OS为29.0(95%CI,27.4-30.6)个月,EGFR基因野生型患者的中位OS为28.0(95%CI,25.4-30.5)个月,两组之间OS无统计学差异(p=0.657)。结论:非小细胞肺癌EGFR基因发生突变的频率与人种、性别、吸烟史以及病理类型等临床背景相关,与高加索人、男性、吸烟患者和非腺癌患者相比,亚裔人群、女性、非吸烟患者和腺癌患者发生EGFR基因突变的频率更高。EGFR-TKI的敏感性与EGFR基因激酶域的活性突变密切相关,EGFR基因突变患者的EGFR-TKI疗效较好,EGFR基因野生型患者EGFR-TKI疗效较差。第二部分:晚期非小细胞肺癌EGFR基因突变状态血清多肽质谱分类模型的建立与验证目的;应用MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱技术寻找与EGFR基因突变状态相关的血清多肽/蛋白,并验证能否建立一个血清多肽/蛋白分类模型对EGFR基因突变状态进行分类,来评估EGFR基因突变状态,以做出恰当的治疗决定。方法:挑选EGFR基因突变状态明确(ARMS法检测肿瘤组织)的III-IV期NSCLC患者入组研究。从EGFR基因突变和野生型患者中各随机挑选50人(共100人)组成训练组,剩余患者组成验证组。采集入组患者一线治疗前血清,应用MALDI-TOF-MS联合Clinprotools v2.1分析软件对血清进行蛋白质指纹图谱分析。用训练组患者波谱数据寻找EGFR基因突变和野生型NSCLC患者之间的血清多肽/蛋白差异,并依据这些差异蛋白建立一个血清蛋白分类模型评估NSCLC患者EGFR基因突变状态,并用验证组患者波谱数据对该血清蛋白分类模型进行验证。同时,对该血清蛋白分类模型识别的EGFR基因突变状态与EGFR-TKI疗效之间的关系进行分析。结果:共有316名患者满足入组条件进入该研究。经ARMS法检测肿瘤组织,明确144名患者为EGFR基因突变患者,172名患者为EGFR基因野生型患者。从2011年5月至2013年4月入组的223名患者中,随机挑选EGFR基因突变和野生型患者各50人(共100人)组成训练组,该时间段入组的其余123名患者(52名患者为EGFR基因突变患者,71名为EGFR基因野生型患者)组成验证组-1。2013年5月至2014年4月入组的93名患者(42名患者为EGFR基因突变患者,51名为EGFR基因野生型患者)组成验证组-2。从训练组患者血清波谱组成的数据集中共识别出129个峰,其中EGFR基因突变和野生型患者之间有9个峰具有统计学差异(p<0.05),m/z分别为1365.1、1866.47、3315.75、3883.79、3956.66、4092.4、4585.05、4643.49和5866.96。用Clin Pro Tools v2.1软件内嵌数学模型分别对训练组波谱数据建立分类模型,其中遗传算法(genetic algorithm,GA)建立的分类模型GA-7区分EGFR基因突变和野生型患者的效果最好。该模型由5个多肽组成,m/z分别为4092.4Da、4585.05Da、1365.1Da、4643.49Da和4438.43Da。用包含123名NSCLC患者的独立验证组-1对分类模型GA-7进行盲样验证,其准确率为80.5%,敏感性为84.6%,特异性为77.5%。ARMS法检测肿瘤组织与蛋白分类模型标记血清两种方法评估NSCLC患者EGFR基因突变状态具有很高的一致性(P<0.001;Kappa value,0.648)。用包含93名NSCLC患者的独立验证组-2对分类模型GA-7进行盲样验证,其准确率为83.8%,敏感性为88.1%,特异性为80.4%。同样,ARMS法检测肿瘤组织与蛋白分类模型标记血清两种方法评估NSCLC患者EGFR基因突变状态具有很高的一致性(P<0.001;Kappa value,0.715)。验证组-1的123名NSCLC患者中,81名患者具有可测量病灶并接受EGFR-TKI治疗。血清样本被标记为“突变”和“野生”的患者,ORR分别为59.6%(28/47)vs.8.8%(3/34),具有统计学差异(p<0.001);该两组患者的DCR分别为87.2%(41/47)vs.35.3%(12/34),同样具有统计学差异(p<0.001)。血清样本被标记为“突变”的患者,中位PFS为10.0(95%CI,9.0-10.9)个月;血清样本被标记为“野生”的患者,中位PFS为2.3(95%CI,1.9-2.7)个月,血清样本被标记为“突变”的患者PFS明显长于血清样本被标记为“野生”的患者(p=0.001)。血清样本被标记为“突变”的患者,中位OS为29.0(95%CI,25.2-32.8)个月,血清样本被标记为“野生”的患者,中位OS为28.0(95%CI,17.7-38.3)个月,两组之间OS无统计学差异(p=0.441)。验证组-2的93名NSCLC患者中,64名患者具有可测量病灶并接受EGFR-TKI治疗。血清样本被标记为“突变”和“野生”的患者,ORR分别为60.0%(24/40)vs.8.3%(2/24),具有统计学差异(p<0.001);该两组患者的DCR分别为87.5%(35/40)vs.29.2%(7/24),同样具有统计学差异(p<0.001)。血清样本被标记为“突变”的患者,中位PFS为11.0(95%CI,9.5-12.6)个月;血清样本被标记为“野生”的患者,中位PFS为2.0(95%CI,1.8-2.2)个月,血清样本被标记为“突变”的患者PFS明显长于血清样本被标记为“野生”的患者(p<0.001)。血清样本被标记为“突变”的患者,中位OS为28.0(95%CI,25.3-30.7)个月,血清样本被标记为“野生”的患者,中位OS为24.0(95%CI,19.2-28.8)个月,两组之间OS无统计学差异(p=0.280)。结论:应用MALDI-TOF-MS联合Clinprotools分析软件对EGFR基因突变状态明确(ARMS法检测肿瘤组织)的NSCLC患者血清进行蛋白质指纹图谱分析,可以找到EGFR基因突变和野生型NSCLC患者之间的血清蛋白差异,依据这些差异蛋白建立一个评估晚期NSCLC患者EGFE基因突变状态的血清分类模型是可行的。该血清蛋白分类模型的分类结果有可能预测EGFR-TKI疗效。第三部分:晚期非小细胞肺癌患者EGFR基因突变状态血清标志物的鉴定目的:尝试对晚期非小细胞肺癌患者EGFR基因突变状态备选血清标志物进行鉴定。方法:以第二部分MALDI-TOF-MS分析血清多肽得到的波谱为依据,选取兴趣蛋白峰高表达的10例患者,各取其蛋白洗脱液5ml合并,冻干,进行MALDI-TOF-MS分析,得到一级肽指纹图谱,在一级肽指纹图谱中挑选感兴趣的肽峰进行MALDI-TOF/TOF-MS分析,得到二级质谱数据,将二级质谱图数据导入Bio Tools软件工具采集肽碎片质荷比信息,并在MASCOT网站进行在线搜库鉴定。结果:m/z为1365.1、1866.47和3883.79的3个蛋白峰得到鉴定,分别为Homer protein homolog 3、Mesogenin-1和REM2-and Rab-like small GTPase 1。结论:应用“铜螯合纳米磁珠(MB-IMAC-Cu2+)联合MALDI-TOF/TOF-MS”对血清肽进行鉴定是可行的。Homer protein homolog 3、Mesogenin-1和REM2-and Rab-like small GTPase 1三个多肽可能与晚期NSCLC患者的EGFR-TKIs疗效相关。