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摘要：目的：探索白血病骨髓基质细胞对白血病细胞凋亡的影响。方法：应用Percoll分离培养骨髓基质细胞，体外培养骨髓单个核细胞，模拟骨髓微环境功能，在体外共培养骨髓单个核细胞和白血病细胞Jurkat。Jurkat细胞用0.5umol/LDNR处理，用Annexin V/PI双标法流式细胞仪检测处理后白血病细胞凋亡率的变化，细胞周期分布用PI染色流式细胞仪进行检测。结果：在共培养后，骨髓基质细胞可以抑制药物诱导的白血病细胞凋亡，与单独悬浮培养组比较显著降低（P<0.05）。白血病细胞凋亡率是（5.69±1.81）%，正常骨髓基质细胞的（8.41±4.09）%（P<0.05）。结论：白血病骨髓基质对白血病细胞的屏蔽效应强于正常骨髓基质细胞，骨髓基质细胞通过阻滞白血病细胞于G 0/G 1期实现，抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡。
关键词：白血病；骨髓基质细胞；细胞凋亡
随着对白血病研究的深入，发现骨髓基质细胞在病理生理过程中，白血病骨髓基质细胞（BMSCs）起重要作用，主要参与白血病细胞恶性克隆的选择、分化、增殖、分泌的细胞因子、血液病发生、恶性血液病细胞凋亡。瘤微环境严重影响肿瘤细胞的生存、对外来药物的敏感性和肿瘤患者预后。研究显示，BMSCs是白血病细胞存活的必要条件之一，是白血病细胞在生存的“土壤”，对患者骨髓内微小白血病的形成起着重要作用，严重影响白血病细胞在化、放疗后的转归。本文主要研究白血病细胞抗凋亡特性和骨髓微环境的关系。
1材料与方法
1.1实验材料与试剂
1.1.1材料
收集我科2014年1～6月在我院就诊的正常骨髓象的骨髓标本18份，其中在正常人群中，男10例，女8例，年龄6～76岁。初治白血病患者的骨髓标本16份，其中男9例，女7例，年龄7～77岁。每份骨髓采集肝素抗凝骨髓1～2 ml/份。
1.1.2试剂
Siam公司的Percoll；Coulter公司的Annexin V凋亡试剂盒。RPMI-1640，Hyclone公司的胎牛血清。Pharmacia&Upjohn公司的柔红霉素（DNR）；Beckman公司的BeckonDickonsin流式细胞仪。美国典型培养物保存中心（ATCC）购自的人急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat。
1.2实验方法
实验分为4组，分别为悬浮培养组，悬浮培养加DNR组，正常BMSC共培养加DNR组，白血病BMSC共培养加DNR组。应用Percoll分离分离培养骨髓基质细胞，体外培养骨髓单个核细胞，模拟骨髓微环境功能，在体外共培养骨髓单个核细胞和白血病细胞Jurkat。Jurkat细胞用0.5umol/L DNR处理，用Annexin V/PI双标法流式细胞仪检测处理后白血病细胞凋亡率的变化，细胞周期分布用PI染色流式细胞仪进行检测。
1.3统计学处理
文中数据采用（x±s），应用t检验进行统计学处理。
2结果
2.1 DNR体外诱导Jurkat细胞凋亡率的变化
对DNR体外诱导Jurkat细胞凋亡率进行分析，结果显示：Jurkat细胞悬浮培养自发凋亡率为（2.75±0.13）%，死亡细胞率为（3.09±2.29）%，凋亡和死亡细胞率为（6.03±2.19）%。经DN R诱导24h后的悬浮培养Jurkat细胞凋亡率为（16.01±1.02）%，明显高于悬浮培养组（P<0.005）；死亡细胞率为（4.59±3.19）%，与悬浮培养组差别不大，凋亡和死亡细胞率为（20.62±2.13）%，也明显高于悬浮培养组（P<0.005）。与原代培养正常BMSC共培养24h后，细胞凋亡率、死亡细胞率低于悬浮培养加DNR组诱导的凋亡实验组（P<0.005）。与白血病BMSC共培养24h后，细胞凋亡率和死亡细胞率较正常BMSC组相比，进一步降低（P<0.05），具体情况见表1。
2.2 DNR体外诱导Jurkat细胞周期的变化
在DNR体外诱导后，各组Jurkat细胞周期变化情况见表2。经DN R处理后，悬浮培养的Jurkat细胞较悬浮培养组G0/G1期细胞周期明显减少，G2/M期细胞则明显增加（P<0.05）。而正常BMSC共培养加DNR组经相同剂量DN R处理后，G0/G 1期细胞数显著增多，G2/M期细胞则明显减少，出现G0/G1期聚集现象（P<0.01）。白血病BMSC与正常BMSC两组之间G0/G1期则无显著差别。
3讨论
在机体正常造血发生过程中，正常骨髓基质细胞起重要作用，可以直接黏附在白血病细胞，参与了白血病的发生和发展过程，对白血病细胞的抗药和抗凋亡等过程也起重要作用。骨髓基质细胞对白血病细胞的保护作用，可以降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，庇护白血病细胞免于药物诱导的凋亡。本研究表明，在共培养后，骨髓基质细胞可以抑制药物诱导的白血病细胞凋亡，与单独悬浮培养组比较显著降低（P<0.05）。白血病骨髓基质对白血病细胞的屏蔽效应强于正常骨髓基质细胞。经DN R处理后，悬浮培养的Jurkat细胞较悬浮培养组G0/G1期细胞周期明显减少，骨髓基质细胞通过阻滞白血病细胞于G 0/G 1期实现，抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡。骨髓内微小白血病灶形成有更复杂的机制，值得进一步深入研究。
参考文献：
[1]成娟，赵丽，李娟，等.正常骨髓基质细胞对K562细胞凋亡敏感性的影响[J].兰州大学学报（医学版），2007；33（2）：1-5.
[2]李忠俊，滕本秀，陈幸华，等.白血病骨髓基质细胞对白血病细胞屏蔽效应的体外实验研究[J].癌症，2005；24（6）：672-675.
[3]Tavernier-Tardy E，Cornillon J，Campos L，Flandrin P，Duval A，Nadal N，et al.Prognostic value of CXCR4 and FAK expression inacute myelogenous leukemia[J].Leuk Res，2009，33（6）：764-768.
关键词：白血病；骨髓基质细胞；细胞凋亡
随着对白血病研究的深入，发现骨髓基质细胞在病理生理过程中，白血病骨髓基质细胞（BMSCs）起重要作用，主要参与白血病细胞恶性克隆的选择、分化、增殖、分泌的细胞因子、血液病发生、恶性血液病细胞凋亡。瘤微环境严重影响肿瘤细胞的生存、对外来药物的敏感性和肿瘤患者预后。研究显示，BMSCs是白血病细胞存活的必要条件之一，是白血病细胞在生存的“土壤”，对患者骨髓内微小白血病的形成起着重要作用，严重影响白血病细胞在化、放疗后的转归。本文主要研究白血病细胞抗凋亡特性和骨髓微环境的关系。
1材料与方法
1.1实验材料与试剂
1.1.1材料
收集我科2014年1～6月在我院就诊的正常骨髓象的骨髓标本18份，其中在正常人群中，男10例，女8例，年龄6～76岁。初治白血病患者的骨髓标本16份，其中男9例，女7例，年龄7～77岁。每份骨髓采集肝素抗凝骨髓1～2 ml/份。
1.1.2试剂
Siam公司的Percoll；Coulter公司的Annexin V凋亡试剂盒。RPMI-1640，Hyclone公司的胎牛血清。Pharmacia&Upjohn公司的柔红霉素（DNR）；Beckman公司的BeckonDickonsin流式细胞仪。美国典型培养物保存中心（ATCC）购自的人急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat。
1.2实验方法
实验分为4组，分别为悬浮培养组，悬浮培养加DNR组，正常BMSC共培养加DNR组，白血病BMSC共培养加DNR组。应用Percoll分离分离培养骨髓基质细胞，体外培养骨髓单个核细胞，模拟骨髓微环境功能，在体外共培养骨髓单个核细胞和白血病细胞Jurkat。Jurkat细胞用0.5umol/L DNR处理，用Annexin V/PI双标法流式细胞仪检测处理后白血病细胞凋亡率的变化，细胞周期分布用PI染色流式细胞仪进行检测。
1.3统计学处理
文中数据采用（x±s），应用t检验进行统计学处理。
2结果
2.1 DNR体外诱导Jurkat细胞凋亡率的变化
对DNR体外诱导Jurkat细胞凋亡率进行分析，结果显示：Jurkat细胞悬浮培养自发凋亡率为（2.75±0.13）%，死亡细胞率为（3.09±2.29）%，凋亡和死亡细胞率为（6.03±2.19）%。经DN R诱导24h后的悬浮培养Jurkat细胞凋亡率为（16.01±1.02）%，明显高于悬浮培养组（P<0.005）；死亡细胞率为（4.59±3.19）%，与悬浮培养组差别不大，凋亡和死亡细胞率为（20.62±2.13）%，也明显高于悬浮培养组（P<0.005）。与原代培养正常BMSC共培养24h后，细胞凋亡率、死亡细胞率低于悬浮培养加DNR组诱导的凋亡实验组（P<0.005）。与白血病BMSC共培养24h后，细胞凋亡率和死亡细胞率较正常BMSC组相比，进一步降低（P<0.05），具体情况见表1。
2.2 DNR体外诱导Jurkat细胞周期的变化
在DNR体外诱导后，各组Jurkat细胞周期变化情况见表2。经DN R处理后，悬浮培养的Jurkat细胞较悬浮培养组G0/G1期细胞周期明显减少，G2/M期细胞则明显增加（P<0.05）。而正常BMSC共培养加DNR组经相同剂量DN R处理后，G0/G 1期细胞数显著增多，G2/M期细胞则明显减少，出现G0/G1期聚集现象（P<0.01）。白血病BMSC与正常BMSC两组之间G0/G1期则无显著差别。
3讨论
在机体正常造血发生过程中，正常骨髓基质细胞起重要作用，可以直接黏附在白血病细胞，参与了白血病的发生和发展过程，对白血病细胞的抗药和抗凋亡等过程也起重要作用。骨髓基质细胞对白血病细胞的保护作用，可以降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，庇护白血病细胞免于药物诱导的凋亡。本研究表明，在共培养后，骨髓基质细胞可以抑制药物诱导的白血病细胞凋亡，与单独悬浮培养组比较显著降低（P<0.05）。白血病骨髓基质对白血病细胞的屏蔽效应强于正常骨髓基质细胞。经DN R处理后，悬浮培养的Jurkat细胞较悬浮培养组G0/G1期细胞周期明显减少，骨髓基质细胞通过阻滞白血病细胞于G 0/G 1期实现，抑制化疗药物诱导的白血病细胞凋亡。骨髓内微小白血病灶形成有更复杂的机制，值得进一步深入研究。
参考文献：
[1]成娟，赵丽，李娟，等.正常骨髓基质细胞对K562细胞凋亡敏感性的影响[J].兰州大学学报（医学版），2007；33（2）：1-5.
[2]李忠俊，滕本秀，陈幸华，等.白血病骨髓基质细胞对白血病细胞屏蔽效应的体外实验研究[J].癌症，2005；24（6）：672-675.
[3]Tavernier-Tardy E，Cornillon J，Campos L，Flandrin P，Duval A，Nadal N，et al.Prognostic value of CXCR4 and FAK expression inacute myelogenous leukemia[J].Leuk Res，2009，33（6）：764-768.