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摘 要：目的：构建多种敲除菌毛基因的气单胞菌并检测菌毛蛋白表达情况。在构建的基础之上为后继的药物和病理研究奠定基础。方法：根据以报道的方法构建敲除菌基因，然后通过免疫印迹检测敲除效果。结果：六种气单胞菌中，A .hydrophila 和 A .veronii biovar sobria的菌毛蛋白敲除不明显， A .jandaei和A .schuber tii and A .trota的菌毛蛋白敲除不彻底，而A .caviae 和A .veronii biovar veronii的菌毛蛋白敲除彻底。结论：本次基因敲除结果基本成功。不足部分可以考虑改进。本次的成果可为后继研究奠定基础。
关键词：气单胞菌；菌毛基因；基因敲除
【基金项目】：邵阳市科技计划项目（2014GK36）
1 简介
气单胞菌是人畜共患病的菌种，可引起腹泻、伤口感染、败血症等一系列疾病。在我国由于气单胞菌引起的疾病日益收到重视，对其的研究也越来越多。本次研究对多种气单胞菌的纤毛基因进行敲除，并通过免疫印迹检测纤毛蛋白表达情况。本次工作对于将来对气单胞菌的病理研究奠定一定的基础。
2 资料与方法
2.1 一般资料
收集邵阳医学高等专科学校附属医院腹泻病人的排泄物，通过分离后培养得到自发抗庆大霉素的多种气单胞菌（：A .hydrophila ， A .veronii biovar sobria ， A .caviae ， A .veronii biovar veronii ， A .jandaei ， A .schuber tii and A .trota）[1]。
2.2 基因敲除
采用与之前报道的方法进行多种气单胞菌基因座的菌毛基因敲除[2]。
2.3 免疫印迹
2.3.1 菌毛蛋白的提取和制备
提取细菌菌体，轻轻的用PBS溶解并洗涤细菌三次。然后在室温条件下，用7000RPM，离心20分钟。弃上清，用少量PBS溶解沉淀。并用一次性针筒吸取混合液后对着EP管壁用力吹出。反复多次。然后在室温条件下，13200RPM，离心25分钟。弃上清，按照上样缓冲液比样本蛋白=2：1混合后，煮沸5分钟。最后再次室温条件下，13200RPM，离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳。
在SDS-PAGE分离蛋白之后，将蛋白由SDS-PAGE电转移到醋酸纤维素薄膜上。用BIO-RAD，在20伏条件下转膜90分钟。用5%（5克脱脂牛奶加入100毫升PBS溶液中）的脱脂牛奶，封闭转膜后的醋酸纤维素薄膜90分钟。丢弃脱脂牛奶，接着用1：500的兔抗气单胞菌毛抗体（Sigma，USA）在4℃，摇晃孵育。第二天，在室温中恢复30分钟后，用PBST（1000PBS：1TWEEN）摇床上洗涤三次。按1：3000加入抗兔的二抗（Sigma，USA），室温下孵育120分钟。最后加入显影液在Dual Intensity Ultraviolet Trans-illuminator中显影。
3 结果
图1.1 ：A .hydrophila ，2： A .veronii biovar sobria，3：A .caviae ， 4：A .veronii biovar veronii ， 5：A .jandaei ，6 A .schuber tii and A .trota，M：marker.从图中可以看到A .hydrophila 和 A .veronii biovar sobria中的菌毛蛋白敲除不明显，而在A .jandaei和A .schuber tii and A .trota中的菌毛蛋白敲除不彻底。A .caviae 和A .veronii biovar veronii中的菌毛蛋白敲除彻底。表明之前设计的蛋白敲除引物，不适用于所有种类的气单胞菌。
4 討论
我们之前的气单胞菌菌毛基因敲除工作已经建立起了比较成熟的技术标准。此次菌毛蛋白敲除的结果可以看到：总共六种气单胞菌，其中有两种基本没有敲除成功，两种敲除完全，剩下两种基本敲除。分析原因在于不同气单胞菌的菌毛基因存在差异，所以在敲除的效果不尽相同。结果也说明A .hydrophila 和A .veronii biovar sobria之间，A .caviae和A .veronii biovar veronii之间，A .veronii biovar sobria和A .caviae之间基因结构相似。而以上三对之间的基因结构差异又存在逐渐变大的趋势。
本次工作中，A .hydrophila 和A .veronii biovar sobria的菌毛敲除效果不明显。可考虑需要重新提取基因组DNA，然后做基因测序。根据基因测序的最后结果重新设计引物，进行基因敲除。本次基因敲除为下一步验证菌毛对气单胞菌的致病能力做了基础性的工作。接下来的工作可以围绕维罗纳具的菌毛粘附能力开展研究，并可以通过比较缺失了菌毛蛋白的多种气单胞菌之间的超别来开展多项研究。菌毛是形成细菌生物膜的重要因素。而生物膜与细菌的抗药性，细菌动力等多项病理学指标。生物膜抗药性是现在研究的热点。可以通过本次构建出的多种菌毛敲除型和野生型比较多项生物学指标，研究菌毛对于气单胞菌致病能力的影响。
参考文献
[1]Bechet ，M .&Blondeau ， R.Aeromonas spp .psssess at least two distinct type4 pilus familiese[ J] .Microb Pathogen ，2003 ，23：241 -247 .
[2]杨秦，黄泽智.维罗纳气单胞维管束状纤毛mshB 基因突变体的构建[J].亚太传统医药，2008，4（10）：14-16.
[3] Van Houdt R，Michiels C W. Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation. J Res Microbiol， 2005， 156（5-6）：626-33
关键词：气单胞菌；菌毛基因；基因敲除
【基金项目】：邵阳市科技计划项目（2014GK36）
1 简介
气单胞菌是人畜共患病的菌种，可引起腹泻、伤口感染、败血症等一系列疾病。在我国由于气单胞菌引起的疾病日益收到重视，对其的研究也越来越多。本次研究对多种气单胞菌的纤毛基因进行敲除，并通过免疫印迹检测纤毛蛋白表达情况。本次工作对于将来对气单胞菌的病理研究奠定一定的基础。
2 资料与方法
2.1 一般资料
收集邵阳医学高等专科学校附属医院腹泻病人的排泄物，通过分离后培养得到自发抗庆大霉素的多种气单胞菌（：A .hydrophila ， A .veronii biovar sobria ， A .caviae ， A .veronii biovar veronii ， A .jandaei ， A .schuber tii and A .trota）[1]。
2.2 基因敲除
采用与之前报道的方法进行多种气单胞菌基因座的菌毛基因敲除[2]。
2.3 免疫印迹
2.3.1 菌毛蛋白的提取和制备
提取细菌菌体，轻轻的用PBS溶解并洗涤细菌三次。然后在室温条件下，用7000RPM，离心20分钟。弃上清，用少量PBS溶解沉淀。并用一次性针筒吸取混合液后对着EP管壁用力吹出。反复多次。然后在室温条件下，13200RPM，离心25分钟。弃上清，按照上样缓冲液比样本蛋白=2：1混合后，煮沸5分钟。最后再次室温条件下，13200RPM，离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳。
在SDS-PAGE分离蛋白之后，将蛋白由SDS-PAGE电转移到醋酸纤维素薄膜上。用BIO-RAD，在20伏条件下转膜90分钟。用5%（5克脱脂牛奶加入100毫升PBS溶液中）的脱脂牛奶，封闭转膜后的醋酸纤维素薄膜90分钟。丢弃脱脂牛奶，接着用1：500的兔抗气单胞菌毛抗体（Sigma，USA）在4℃，摇晃孵育。第二天，在室温中恢复30分钟后，用PBST（1000PBS：1TWEEN）摇床上洗涤三次。按1：3000加入抗兔的二抗（Sigma，USA），室温下孵育120分钟。最后加入显影液在Dual Intensity Ultraviolet Trans-illuminator中显影。
3 结果
图1.1 ：A .hydrophila ，2： A .veronii biovar sobria，3：A .caviae ， 4：A .veronii biovar veronii ， 5：A .jandaei ，6 A .schuber tii and A .trota，M：marker.从图中可以看到A .hydrophila 和 A .veronii biovar sobria中的菌毛蛋白敲除不明显，而在A .jandaei和A .schuber tii and A .trota中的菌毛蛋白敲除不彻底。A .caviae 和A .veronii biovar veronii中的菌毛蛋白敲除彻底。表明之前设计的蛋白敲除引物，不适用于所有种类的气单胞菌。
4 討论
我们之前的气单胞菌菌毛基因敲除工作已经建立起了比较成熟的技术标准。此次菌毛蛋白敲除的结果可以看到：总共六种气单胞菌，其中有两种基本没有敲除成功，两种敲除完全，剩下两种基本敲除。分析原因在于不同气单胞菌的菌毛基因存在差异，所以在敲除的效果不尽相同。结果也说明A .hydrophila 和A .veronii biovar sobria之间，A .caviae和A .veronii biovar veronii之间，A .veronii biovar sobria和A .caviae之间基因结构相似。而以上三对之间的基因结构差异又存在逐渐变大的趋势。
本次工作中，A .hydrophila 和A .veronii biovar sobria的菌毛敲除效果不明显。可考虑需要重新提取基因组DNA，然后做基因测序。根据基因测序的最后结果重新设计引物，进行基因敲除。本次基因敲除为下一步验证菌毛对气单胞菌的致病能力做了基础性的工作。接下来的工作可以围绕维罗纳具的菌毛粘附能力开展研究，并可以通过比较缺失了菌毛蛋白的多种气单胞菌之间的超别来开展多项研究。菌毛是形成细菌生物膜的重要因素。而生物膜与细菌的抗药性，细菌动力等多项病理学指标。生物膜抗药性是现在研究的热点。可以通过本次构建出的多种菌毛敲除型和野生型比较多项生物学指标，研究菌毛对于气单胞菌致病能力的影响。
参考文献
[1]Bechet ，M .&Blondeau ， R.Aeromonas spp .psssess at least two distinct type4 pilus familiese[ J] .Microb Pathogen ，2003 ，23：241 -247 .
[2]杨秦，黄泽智.维罗纳气单胞维管束状纤毛mshB 基因突变体的构建[J].亚太传统医药，2008，4（10）：14-16.
[3] Van Houdt R，Michiels C W. Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation. J Res Microbiol， 2005， 156（5-6）：626-33