喜树碱（Camptothecin,CPT）是喜树中重要的次生代谢产物,其衍生物作为抗肿瘤药物,在临床中被大众认可。喜树碱主要从喜树叶片和果实中提取,由于其在植株组织中含量较低,因此,只有大量的供应原料,才能够应对庞大的市场需求。转录因子作为药用植物次生代谢产物的重要调控因子一直倍受关注。研究表明,长春碱与喜树碱都属于萜类吲哚生物碱,两者存在着一些共同的代谢途径;此外,有研究显示,在长春花中存在ORCA（Octadecaniod-derivative Responsive Catharanthus AP2-domain protein）类转录因子对长春碱的生物合成具有显著的促进作用,其通过作用于上游途径关键酶基因,进而促进长春质碱的生物合成。然而,喜树中ORA类转录因子鲜有报道,因此,克隆该类转录因子,并研究其在喜树中的功能以及最终应用其提高其喜树碱的积累具有重要意义。本文首先利用同源序列比对,在喜树转录组数据库中找到与ORCA高度同源的一个转录因子,并将之命名为ORA1;利用分子生物学手段从喜树叶片中克隆该ORA1,构建过表达载体p BI121GD-ORA1和低温诱导表达载体rd29A::ORA1。系统发育分析结果表明,ORA1的蛋白质结构域处和长春花中ORCA蛋白质和拟南芥基因组中几个ERF基因的蛋白质序列同源性很高,且它们的结构域处非常保守。一级、二级结构以及三级结构预测结果显示,ORA1蛋白分子式为C1209H1924N346O374S4,由249个氨基酸组成,大小为27.4 KDa;ORA1蛋白质蛋白质总长的61.04%为无规则卷曲,α-螺旋和延伸链分别占23.29%和12.05%;三级结构预测所得模型与二级结构预测结果相符。然后,通过农杆菌介导瞬时转化手段,在喜树叶片中瞬时过表达该目的基因ORA1。利用高效液相色谱测定p BI121GD-ORA1,组成型过表达ORA1对喜树叶片中喜树碱合成量影响,结果显示,喜树碱合成量提升了68%。同时,利用Real Time PCR技术测定ORA1组成型过表达及低温诱导表达（0 h、24 h和48 h）喜树叶片中喜树碱合成途径关键酶基因的转录水平。结果显示,ORA1组成型过表达后,Ca7DLGT、Ca G8O、Ca7DLS、Ca CYC1和Ca STR分别上调至对照组的19.0、4.2、2.0、4.9和25.0倍,对合成途径上游关键酶基因的影响尤为显著,同时对茉莉酸（JA）响应基因Ca JR3和JA合成基因Ca AOC2有促进作用。此外,我们发现,在低温诱导瞬时过表达ORA1喜树叶片中,经24 h的4℃低温诱导后,实验组与对照组相比,喜树碱合成途径上游关键酶基因的表达均有所上调,如Ca G8O、Ca7DLS、Ca7DLGT、Ca CYC1和Ca STR分别提高为0 h的6.8、10.38、6.68、7.7和23.95倍,JA合成关键酶基因Ca AOC2上调了4.04倍,JA信号响应基因Ca JR3上调为对照组的4.85倍。上述结果表明,在喜树叶片中过表达ORA1会促进喜树碱合成上游途径中的Ca STR、Ca G8O和Ca7DLS等基因的表达量上调,进而促进喜树碱合成,同时ORA1与JA信号相关。本研究,成功克隆了喜树中的转录因子ORA1,并利用其在喜树中进行瞬时过表达,成功提高了喜树碱合成的积累量。并初步确定其可能通过促进JA合成及其信号转导,进而促进喜树碱合成上游途径关键酶基因Ca STR、Ca CYC1和Ca7DLS等的表达上调,最终促进喜树碱的生物合成。本文为研究转录因子ORA1调控喜树碱合成的分子机制提供了数据支持,同时为利用喜树中转录因子最终调控喜树碱的合成提供新的研究策略。